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博濟醫(yī)藥科技股份有限公司
股票代碼為（300404）創(chuàng)建于2002年，2015年在深圳創(chuàng)業(yè)板上市，是一家為國內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)提供藥品、保健品、醫(yī)療器械研發(fā)與生產(chǎn)全流程“一站式”外包服務(CRO)的型高新技術企業(yè)，同也提供藥品上市許可持有人(MAH)服務。
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藥品研發(fā)“一站式”服務包括：新藥立項研究和活性篩選、藥學研究(含中試生產(chǎn))、藥理毒理研究、臨床用藥與模擬劑的生產(chǎn)、臨床試驗、臨床數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計分析、上市后再評價、技
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公司擁有近3000平米的現(xiàn)代化辦公場所，匯聚了超1000名經(jīng)驗豐富，學識淵博，思維敏捷的中高級醫(yī)藥研究人才和注冊法規(guī)專家。
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公司新聞
袁來如此｜大分子生物分析概論（八_下）：LBA方法質量控制樣品的制備和認證
作者： 時間：2021-06-10 來源：

上周，“袁來如此”專欄初步介紹了LBA中的質量控制樣品（QC，quality control）制備、認證（qualification）和批次一致性維護的相關概念和實踐方法（袁來如此｜大分子生物分析概論（八_上）：LBA方法質量控制樣品的制備和認證）。本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點就監(jiān)管機構對QC的要求、跟蹤QC的效能趨勢、防止分析漂移等方面做了詳細解讀。


“袁來如此”專欄系廣州博濟醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學術專欄，內(nèi)容均為博濟醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。


監(jiān)管機構對于QC的態(tài)度
LBA測試中的QC樣品，應通過在合格（qualified）的基質中加入已知濃度的參考（比）標準品（用于PK定量分析），或稀釋/濃縮的含有陽性對照抗體的原液（用于ADA測試）來制備。關于QC樣品的組成、目標值和接受標準的通用指南，已由下述監(jiān)管機構發(fā)布：美國FDA，歐洲藥監(jiān)局(EMA)，日本衛(wèi)生部，勞動和福利(MHLW)和巴西衛(wèi)生監(jiān)察局(ANVISA)。表3總結了監(jiān)管機構對于定量（PK）分析中所使用的QCs的制備和組成的要求。

表3.監(jiān)管機構對用于定量分析QC的要求之比較。



& 應按照確立的方法制備QCs。
& 對于LBA定量方法，如PK分析，最少需要QC低、中、高三個濃度水平。高濃度QC的濃度大約是定量上限（ULOQ）的75%，中濃度QC的點相當于定量范圍的幾何中心（geometric center，定量下限和定量上限的中心點），低濃度QC是定量下限（LLOQ）的三倍或更低的濃度。QC濃度點應該包含在高濃度及低濃度校準點（calibrators）之間，否則即使?jié)M足%CV和%RE也不能接受。
&對于LBA定性分析，如ADA測試，需要高濃度和低濃度陽性對照（HPC和LPC）；中濃度的QC通常包含在研究前驗證中，但在真實樣本分析過程中是可以不用的。相關指南文件中沒有提供關于HPC外加濃度的具體要求。對于LPC的指導建議是，在所制備QC的濃度水平中，有大致1%的失敗率。這意味著每100個LPC中有1個預計會落在篩選微孔板的切點之外。
& 所有QC應當按照研究樣本的預期存儲條件和已驗證的分析測試方法，以一次性使用的分裝方式保存?zhèn)溆谩?/span>
不屬于監(jiān)管機構要求，但同樣是良好做法的其它建議包括:
& 制備足夠數(shù)量的QC樣品，以支持方法驗證、短期和長期穩(wěn)定性研究以及至少一項生物樣本分析研究。
& 可以制備大量的QC，以達到可使用數(shù)年的數(shù)量。如果已經(jīng)進行了或正在進行的研究（能在報告研究樣本的分析結果之前提供相關穩(wěn)定性數(shù)據(jù)）表明穩(wěn)定性評價覆蓋了整個存儲窗口期。
跟蹤QC的效能趨勢
2011年，美國FDA發(fā)布的《生產(chǎn)過程驗證指南》介紹了制藥過程生命周期管理的概念并建議：一旦建立和驗證了每個過程的性能規(guī)范（performance specifications），就要對這些過程的質量進行監(jiān)控。Sondag和Schofield建議也將檢測/分析方法納入生命周期管理，分析實驗室負責制定分析趨勢的內(nèi)部指南。
這些指導方針應預先確立，以防止研究過程中出現(xiàn)的問題。在理想情況下，趨勢研究應在研究前驗證時開始或者不遲于第一次生物樣本分析。
2018年FDA的生物分析指南已經(jīng)解決了對QC樣品性能的監(jiān)控以及對任何漂移潛在原因的評估。盡管FDA沒有提供如何進行監(jiān)測的準則，但值得注意的是，F(xiàn)DA提供了用于CLIA的趨勢跟蹤方法，在某種程度上該方法也適用于LBA。因為CLIA要求多名分析人員，在多天內(nèi)，多次運行不同的QC組合（QC sets）。QC趨勢可以是實時的，也可以是間接的（Scherder和Giacoletti討論了兩種方法的區(qū)別），大多數(shù)SPC工具的設計目標是盡早發(fā)現(xiàn)QC的漂移（shifts），以便制定和實施適當?shù)募m正措施。
統(tǒng)計過程控制
統(tǒng)計過程控制（Statistical Process Control，SPC）是一種評估QC趨勢的方法論，用于確保一個系統(tǒng)按預期持續(xù)運行。SPC分析的兩個主要目標是：(a)確認過程處于統(tǒng)計控制狀態(tài)；(b)度量其產(chǎn)生符合特定規(guī)范結果的能力。
SPC推薦以下步驟:
1.使用初始QC數(shù)據(jù)（如n=30）計算平均值和標準差(SD)；
2.使用平均值和標準偏差建立質量控制界限（QC limits）；
3.建立所有其它QC規(guī)則（QC rules）；
4.使用質量控制圖表和建立的質量控制規(guī)則來監(jiān)控過程中的趨勢。
如果一個過程或方法能夠預測未來的結果，那么它就處于統(tǒng)計控制狀態(tài)。這意味著必須理解該過程中的每一個變異性的來源。質量控制圖表用于監(jiān)控過程中的意外變化和漂移/位移(表現(xiàn)為系統(tǒng)性偏差)，控制圖表有助于識別有害的分析測試事件，如果能夠建立異常結果與方法參數(shù)改變（如不同的稀釋劑批次、基質批次或分析人員）之間的相關性 。QC趨勢分析中的控制圖的主要類型包括QC的運行趨勢圖（run charts），Xbar-R圖，組平均值的單個控制圖（平均值的運行趨勢圖）。
運行圖表是繪制每個趨勢測量的最簡單的圖。運行圖表通常與顯示一種測量值與另一種測量值之間差異的移動幅度圖結合。Levey-Jennings(17)是LBA最常用的運行圖表(圖1)。另一種常見的控制圖是Xbar-R圖。這種圖表類型演示了每組數(shù)據(jù)的平均值及其范圍的趨勢。
圖1. Levey-Jennings圖示例。水平紅線為下/上限值（lower/upper control limits，L/UCL）；虛線水平橫線為觀測平均值（μ0）。

這些圖表的控制限制是基于檢測內(nèi)的可變性建立的，這使得它們不太適合LBA QC趨勢分析。
圖2是Xbar-R圖的一個例子。此圖還演示了這些圖表類型是如何導致錯誤警報的。替代Xbar-R圖表的是個體值控制圖, 標繪的值是每個試驗的平均值，這些是平均值運行圖表。與Xbar-R圖相比，平均值運行圖的平均控制限度是基于試驗間的變異性計算的。對于添加一個Xbar-R圖表到平均值運行圖上用于監(jiān)控分析內(nèi)變化趨勢仍然是有用的。
圖2. Xbar-R圖的示例。Xbar圖表顯示了每個實驗的平均值；底部是R圖，表示每個分析的觀察范圍。對于這兩張圖，水平的紅線是下限值和上限值; 水平黑線虛線是實驗中觀察到的平均值。

限于篇幅，相關圖表就介紹到此，對所有細節(jié)感興趣者請參閱文末的參考文獻。
防止分析漂移
LBA的性能取決于其生物試劑組成的性能。這類分析方法嚴重依賴于蛋白質與蛋白質相互作用和分析試劑的結合特性，所有這些都影響分析組分對目標待測物的反應活性。隨著時間的推移，這些因素使LBA容易發(fā)生校準偏移（calibration drift）。
例如，蛋白質脫酰胺化或僅由一個糖基改變的糖基化模式就可能導致偏移。校準偏移的早期跡象包括但不限于校準曲線的斜率和漸近線的變化，分析中定量上限和下限的偏移，所有這些都可能導致樣本濃度計算過低或過高。最終，校準偏移導致對藥物動力學的錯誤描述。作為補充材料的一部分，提供了LBA校準偏移的常見原因列表。
以下部分提供了預防方法偏移的評估和緩解策略。不管出于何種根本原因，以下參數(shù)均有助于識別效能偏移（performance drift）:
標準曲線
& 監(jiān)測校準點濃度-響應關系，以確保校準曲線的響應值，特別是零和高濃度點的響應值，與研究前驗證期間觀察到的響應值相比，沒有變化。這確保了LLOQ和ULOQ基本完整，其變異性（variability）與驗證中所觀察到的一致。
& 確保校準曲線的斜率和漸近線與方法驗證期間觀察到的變異性一致。
& 選擇適當?shù)奶鎿Q校準品原液/參照品（reference standards），其效能特征與現(xiàn)有的校準品最相似。
& 確保滿足先前建立的等價條件（equivalence criteria）。
& 關于校準曲線性能的其它建議，可以參考本文末DeSilva/Viswanathan/Azadeh等人的文章。
質量控制樣品
& 根據(jù)之前建立的程序，交叉評估現(xiàn)有的和替換的QCs和/或校準曲線。加入陰性對照品和覆蓋了測試范圍的陽性對照品。
& 追蹤合格的QCs遺留批次和替換批次的測量值之間的百分比（%）差異。
& 長期監(jiān)控應包括上述遺留批次的百分比（%）差異的趨勢 (或標稱值，如果沒有遺留批次)。
& 建議包括稀釋的QC。
& 確保滿足先前建立的等價條件（equivalence criteria）。
金標準樣品（gold standard samples，Proficiency Panel）
金標準樣品，例如美國藥典（USP）或世衛(wèi)組織標準（WHO）的標準品，可能只適用于臨床實驗室的檢測，但如果可以獲得時，可用于：
& 同時評估金標準樣本和QC樣品，有助于識別校準曲線的漂移以及替換QCs的質量認證。
& 如果金標準樣品不存在,可以保留一組具有足夠穩(wěn)定性的研究樣本，在未來替代QCs樣品的質量認證中作為金標準。
雖然控制圖（control charts）是有效的監(jiān)測工具，但它們僅利用從各自的校準曲線得出的QC樣品的檢測濃度。這意味著校準曲線和QC批次都是由相同的試劑制備的。交叉評估現(xiàn)有和替代QCs是正確的趨勢分析和防止漂移的關鍵方法。在這方面，保留遺留的QC批次，并將它們與新QC批次橋接起來就顯得頗為重要。因此，趨勢研究和漂移監(jiān)測最有效的方法就是交叉評估，即根據(jù)現(xiàn)有和替換的校準曲線來評估任何給定的QCs的效能。
在保持可靠的趨勢和檢測漂移上，關鍵是下列問題：
1. 一個適當?shù)摹⒑细竦幕旌匣|：經(jīng)過驗證的分析方法應明確認證替換混合基質的測試設計和接受標準。
2. 適當?shù)倪\行次數(shù)：有助于最大限度地降低可變性。
3. 每次運行使用足夠/適當數(shù)量的QC：大多數(shù)機構指南以及大量文獻都提出了相關建議。
4. 適當?shù)奈恢每勺冃裕簩C樣品置于微孔板的左上和右下四分位點，或適當?shù)胤胖迷谶\行開始和結束的時候 (使用Lever-Jennings原則來監(jiān)測QC的效能)。
5. 在方法開發(fā)的早期和預研究驗證中引入變化性的條件：不同的分析人員、不同時間段、多個微小規(guī)模的制備工作都是為了捕獲變化因素。
討論
成功地管理LBA方法的生命周期是通過證明質量控制樣品（QCs）效能的一致性而實現(xiàn)的。由于QCs是關鍵的監(jiān)控工具，所以實驗室必須建立相關標準程序（SOPs），以制備、認證QCs并監(jiān)測其效能趨勢。本文旨在提供：1.與LBA的QCs相關的指南和最佳做法，同時在生物分析界建立共識；2.提出了更換QC批次的認證方法，并提供了監(jiān)測QC效能的實用方法；3.討論了管理和應對QCs樣品的各種問題，可以作為生物分析實驗室的參考文獻。
特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關指南和數(shù)據(jù)的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學術期刊、官方網(wǎng)絡報道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。
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參 考 文 獻
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