本期《袁來如此》為系列文章《大分子生物分析概論》的第八篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻資料，初步介紹LBA中的質(zhì)量控制樣品（QC，quality control）制備、認證（qualification）和批次一致性維護的相關(guān)概念和實踐。
由于內(nèi)容篇幅較長，本文將采取上下篇形式進行推送，敬請垂注！《袁來如此》專欄系廣州博濟醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。
配體結(jié)合測試方法（LBA）的性能，在研究前方法驗證和研究中樣本分析期間，體現(xiàn)在QC的效能。需要采用嚴格和既定的方法合理地管理QC樣品的生命周期，內(nèi)容包括制備、質(zhì)量控制以及QC性能的監(jiān)控。
雖然在監(jiān)管機構(gòu)的指南和有關(guān)LBA的文獻中有關(guān)于QC樣品的制備和認證接受標準（acceptance criteria）的相關(guān)討論，但此類文獻只是較為初步地討論了這些參數(shù)，且只涉及方法開發(fā)和研究前驗證的階段，并沒有對QC生命周期管理的問題和對這一過程至關(guān)重要的因素做出討論和解答。關(guān)于新QC批次的生產(chǎn)和認證（用來保持QC批次間的一致性和防止測試結(jié)果偏移）的許多問題仍然沒有得到解決。此外，大多數(shù)生物分析實驗室缺乏健全的方法或統(tǒng)計工具來監(jiān)測QC趨勢，而這種監(jiān)測對于QC性能以及生命周期的管理是至關(guān)重要的。
本文旨在填補這一方面的空白，為QC樣品生命周期的管理及其組成部分提供指導、建議和最佳實踐。這其中包括：QC的制備、認證和其性能趨勢的監(jiān)控。幫助生物分析實驗室，在其標準操作程序 （SOPs）中，定義QC的認證，并制定批次間一致性的指導原則。應當在已驗證的分析方法或每個實驗室的樣本分析計劃中，對研究和分析方法特異性的具體要求（assay- and study-specific requirements）和規(guī)范加以考慮和做出詳細說明。本文主要側(cè)重于用于LBA定量和定性分析中的QC，如藥代動力學（PK）和抗藥物抗體（ADA）的測試。其他類別的測試方法不在討論的范疇。
標準品（Reference standard）、混合樣本基質(zhì)、QC的組成成分、設備和生產(chǎn)策略都是制備用于LBA的QC樣品的關(guān)鍵因素。以下各節(jié)將根據(jù)這些因素展開討論。
QC樣品應使用與研究樣本基質(zhì)相似，且盡可能與其接近的基質(zhì)來制備。例如，如果研究樣本是未過濾、未離心或未經(jīng)活性炭處理的血清，則QC基質(zhì)也應是未過濾、未離心或未經(jīng)活性炭處理的同一物種的血清。應使用未稀釋（100%）的基質(zhì)制備QC樣品，以便對QC樣品與研究樣本采取相同的稀釋步驟[如最低稀釋度（minimum required dilution，MRD）]。
但不排除特殊情況，例如用替代基質(zhì)代替稀有的研究基質(zhì)（通常很難獲得足夠數(shù)量的稀有基質(zhì)包括：腦脊液、關(guān)節(jié)腔滑液或來自某些物種的眼部基質(zhì)（ocular matrices）等），但這需要適當?shù)睦碛桑⑶抑辉试S在需要保留基質(zhì)（matrix conservation）的情況下使用。緩解基質(zhì)體量問題的推薦方法是在替代基質(zhì)中準備3個QC水平中的2個，而在研究基質(zhì)中制備一個濃度的QC。如果使用替代基質(zhì)，則需要證明其與研究基質(zhì)具有等效性。最好使用與制備標準品（calibrators）相同批次的基質(zhì)來制備QC樣品，以增強方法的一致性和重現(xiàn)性。
中間原液（intermediate stock）是用于制備QC樣品的待測物溶液，可以在下列稀釋劑中制備，如水、緩沖液或有機介質(zhì)（organic media）。當中間原液是水或緩沖液時，QC的最終成分至少為95%（v/v）的樣本基質(zhì)；當使用有機溶劑（如DMSO或乙酸）制備時，最終成分至少為99%（v/v）的樣本基質(zhì)。
應當分別制備QC樣品與標準品，以防止加入待測物時的系統(tǒng)性誤差。建議使用不同的中間原液和不同的稀釋步驟來制備QC樣品和標準品，還建議在每個濃度中獨立加入待測物，而不是通過序列稀釋（serial dilutions）高濃度的QC樣品。這一點尤為重要，因為標準品如果是通過高濃度樣品的序列稀釋制備的，序列稀釋QC樣品和標準品能夠掩蓋稀釋線性度的問題，應該避免這種操作。
在QC制備時，PK定量分析中的標準品（reference standard）或ADA檢測中的陽性對照品（positive antibody control）必須在其有效期內(nèi)。應該單獨建立QC樣品的穩(wěn)定性和有效期（與用于制備的標準品無關(guān)），因為QC樣品中的待測物是在基質(zhì)之中，與原液中的標準品是不同的。
可以制備、分裝和儲存將標準品用研究基質(zhì)或適當稀釋劑稀釋時所產(chǎn)生的中間原液，以供未來制備QC樣品或標準品。在這種情況下，中間原液的穩(wěn)定性應覆蓋其儲存窗口期，即從其制備日期起至使用日期為止。這可以通過比較下述2種樣品來實現(xiàn)：1. 從凍存的中間原液（frozen intermediate stock）制備的標準品和/或QC樣品；2. 使用初始的標準品原液（original reference standard stock）制備的標準品和/或QC樣品。
正確地選擇用于制備QC樣品的基質(zhì)，對于保證分析方法的質(zhì)量和防止分析結(jié)果漂移是至關(guān)重要的。這在ADA檢測中尤其重要，因為合格的基質(zhì)（QMP），作為陰性對照（NC），將直接影響微孔板特異性的切點，必須在已驗證的定量分析方法中或適當?shù)腟OP中，建立并明確規(guī)定適當?shù)幕|(zhì)篩選（screening）、選擇（selection）過程以及接受標準。有關(guān)基質(zhì)質(zhì)量認證（qualification）的建議總結(jié)如下。
第一個合格基質(zhì)的批次認證通常是作為分析方法開發(fā)的一部分進行的，并在方法驗證時進行正式的認證。
& 認證足夠體量的合格基質(zhì)，足以在多個研究和多個藥物開發(fā)階段一直使用。至少，有足夠體量的合格基質(zhì)可以滿足研究前驗證以及一項或多項生物樣本分析研究。
& 合格基質(zhì)的儲存條件與預期研究樣本的儲存條件一致（如-20℃或-80℃）。
& 制備混合基質(zhì)（matrix pool）的第一步，是通過比較未添加和添加了待測物的基質(zhì)樣本所產(chǎn)生的分析信號，來篩選單個基質(zhì)樣本或混合基質(zhì)樣本（多個、單個樣本的混合物）。
& 作為背景值，考察未添加待測物的基質(zhì)樣本的響應值。應當將背景異常高的基質(zhì)樣本剔除，例如，高于PK定量下限（LLOQ）或高于ADA預估切點的樣本。對于ADA分析，背景異常低也可能有問題。
& 對于PK定量分析，可根據(jù)分析方法或?qū)嶒炇襍OP中確定的接受標準來評估添加了待測物的基質(zhì)樣本。如建議相對誤差（RE）的接受標準在±20%范圍內(nèi)；建議在LLOQ和低QC(LQC)之間的濃度水平上添加待測物到單個基質(zhì)樣本，并且至少在一次分析運行中這樣做。
& 對于ADA分析，必須強調(diào)空白信號（blank signal，NC）的重要性。當沒有其它批次的基質(zhì)可比較時，建議在篩查測試(screen，Tier 1)中評估單個基質(zhì)樣本，并比較組內(nèi)各個樣本的響應值，以評估其原始響應值。應將所有異常高響應值或低響應值的單個基質(zhì)排除在替換混合基質(zhì)（replacement matrix pool）之外。在可能的情況下，還應將混合基質(zhì)（matrix pool）與一組疾病狀態(tài)的基質(zhì)樣本進行比較，以確定其合用性（suitability）。
& 對于PK定量分析，混合基質(zhì)的背景的接受標準，可以是比預估的LLOQ低2-3倍的基質(zhì)響應。ADA分析的接受標準，可以是低于預估的切點或在特定的響應范圍內(nèi)。
& 使用與認證第一批次相同的分析方法，對替換批次的基質(zhì)樣本進行認證。
–確保未外加待測物的現(xiàn)有的和替換的合格基質(zhì)（QMP）的響應值具有可比性。
–對于PK定量分析，應當將替換基質(zhì)批次與現(xiàn)有合格批次進行比較。至少在一次分析運行中，分析添加了待測物標準品的樣本（濃度在LLOQ和LQC之間，至少n=3）。標準品（reference standard）的分析回收率(AR)，在現(xiàn)有和替代批次的基質(zhì)中，都應在80至120%的范圍內(nèi)。同時，使用兩個基質(zhì)批次制備的樣本所測定的標準品濃度之差不超過10%。
–為了認證ADA分析中的替換合格基質(zhì)（replacement QMP），應當使用先前建立的微孔板特異的切點因子，對單個基質(zhì)樣本進行篩查。篩查測試中是陽性的所有單個樣本都應排除在替換合格基質(zhì)之外。另一種方法是直接考察每個基質(zhì)樣本的信噪比(S/N)，應將超過經(jīng)過驗證的切點因子的基質(zhì)樣本排除在替換合格基質(zhì)之外。
以下推薦的是替換合格基質(zhì)的接受標準: 替換基質(zhì)批次的響應值，應當在現(xiàn)有基質(zhì)批次響應值的±10%以內(nèi)。如果不是，則應當評估一組單個基質(zhì)樣本，并與兩個微孔板特異的切點比較，以確定篩查結(jié)果是陽性或陰性。其中一個切點是用現(xiàn)有合格基質(zhì)的陰性對照計算的，另一個切點是用替換合格基質(zhì)制備的陰性對照計算的。使用這兩個切點（現(xiàn)有vs.替換微孔板特異的切點）所得出的篩查結(jié)果（陰性/陽性狀態(tài)）應當相似（comparable），但borderline samples，根據(jù)基質(zhì)響應，可能是陽性或陰性。
在PK分析中，基質(zhì)的背景響應應保持在最低狀態(tài)，因為它影響分析靈敏度，并可能限制定量的范圍。對于ADA分析，建議一旦獲得驗證數(shù)據(jù)，就應盡快確定基質(zhì)響應范圍的上限和下限。
& 在非競爭性定量（如PK）免疫測試中，基質(zhì)背景不應超過LLOQ的1/3。
& 在競爭性免疫分析中，背景值至少為最低校準點數(shù)值的1.11倍。這是基于B/B0（最低校準點信號/零校準點信號，lowest calibrator signal/zero calibrator）建議的90%（100/90）。
& 在ADA和其他非定量分析中，對基質(zhì)背景的一般建議是相對發(fā)光單位（RLUs）≤200和吸光度≤0.200。有些測試方法的基質(zhì)背景則比上述建議的要高。
& 基質(zhì)背景的下限由儀器響應決定，不同儀器和不同實驗室的儀器響應可能不同。
& 用于制備QC樣品的設備，包括移液器，應進行精密度驗證，并應在校準范圍內(nèi)。
& 設備校準的過程和頻率應在SOP中規(guī)定明示。
& 在一些實驗室，除了定期校準之外，還需要在使用移液器制備QC樣品之前進行額外的校準檢查，但在一些實驗室，如果定期校準仍然有效，則不需要重新進行校準檢查。
此處的一般運行接受標準適用于現(xiàn)有和替換QC批次的認證。此處下列術(shù)語：基線批次（baseline QC lots）、遺留QC批次（legacy lots）或QC比較批次（comparator QC lots）可互換使用。
1. QC樣品可與之前認證過的，且有已知穩(wěn)定性的凍存校準品進行比對和認證。如果沒有合格的凍存標準品，則應使用重新制備的標準曲線對QC樣品進行評估。在后一種方法中，需要加入之前認證過的一組QC樣品對新鮮制備的標準曲線進行認證。
2. 認證（qualification）是通過評估分析內(nèi)和分析間的精密度（inter- and intra-assay precision，對所有方法）和準確度(對定量方法)來進行的。
3. 對定量和藥代動力學分析方法，QC樣品必須滿足精密度和準確度標準：變異系數(shù)(coefficient of variation，CV) ≤20%，RE在±20%之內(nèi)；定量下限（LLOQ）和上限（ULOQ）：CV≤25%，RE在±25%之內(nèi)。
1. QC樣品應滿足CV≤20%的標準。
2. 現(xiàn)有和替換QC的響應值都應在其相應濃度級別已建立的響應范圍內(nèi)。如果替換的QC批次不在相應的信號范圍內(nèi)，則實驗室必須排除故障并確定其根本原因。ADA陽性對照（PC）和陰性對照（NC）信號漂移的潛在原因包括：(a)待測物添加錯誤；(b) 混合基質(zhì)選擇不當；(c)信號范圍設定不正確。
后續(xù)的故障排除應遵循以下順序: 首先準備一個新批次的QC樣品，如果重復制備的QC仍然失敗，則認證一個新批次的合格基質(zhì)（QMP）；然后重新制備陽性和陰性對照，如果新制備的陽性和陰性對照仍然在其信號范圍之外，則納入研究中測試運行得出的額外數(shù)據(jù)，進而重新評估已建立的信號范圍。每個實驗室應當根據(jù)足夠的測試運行次數(shù)所得出的數(shù)據(jù)，適當?shù)卮_定驗證后信號范圍，以避免將其范圍設置得過窄或者不適合長期使用。
3. 接受標準：高陽性對照（HPC）>低陽性對照（LPC）>切點>陰性對照。
1. 建議在每次認證的測試運行中，至少測試3組現(xiàn)有和替換QC樣品。在這個要求上，個別實驗室可能會有所不同。
2. 至少三分之二的測試運行應滿足上述規(guī)定的接受標準。這些認證要求和建議見表I。
3. 現(xiàn)有的和替換的QC樣品必須滿足上述的常規(guī)運行接受標準。
4. 如果替換批次的QC樣品不符合上述接受標準，而現(xiàn)有批次合格時，則應將替換批次廢除，并制備另一批次的QC樣品。當一個濃度水平的替換QC樣本不合格時，可以重新制備該濃度水平的QC。
5. 如果現(xiàn)有的QC批次在替換批次的認證過程中未能通過接受標準，則應重新分析以確認相關(guān)結(jié)果。如果現(xiàn)有的批次在重復分析后仍然不合格，那么它就不能用作比對品（comparator）。在這種情況下，應遵循<現(xiàn)有合格批次不存在時的認證>章節(jié)所描述的程序和質(zhì)量標準。
第一個批次的QC樣品，也被稱為基線（baseline）或遺留（legacy）批次，通常作為研究前方法驗證中的準確度和精密度（A&P）評估的一部分進行認證。對研究前方法驗證中的QC批次進行認證時，推薦至少進行獨立運行6次，每個QC濃度至少運行3次，至少分2天進行，至少2名分析人員參與。且要求至少4/6的QC認證運行應該滿足接受標準，才滿足對該批次QC認證（見表1）。在可能的情況下，還建議將該QC批次與方法開發(fā)時所用的QC樣品建立橋接聯(lián)系。對這種橋接性評價的接受標準將由各個獨立的實驗室自行制定， 推薦二者之間的誤差為±10%或更低。特定樣品的運行接受標準必須滿足常規(guī)運行接受標準。
i. 通過與現(xiàn)有合格QC批次比較的認證
在研究前的方法驗證之外，每次制備替換批次QC樣品時，通過與之前認證了的（合格）批次的比較，對替換批次進行認證。為了可靠地進行可比性評估，必須使用相同的凍存或新鮮制備的標準曲線來評估現(xiàn)有的和替換的QC批次。
一個替換批次的QC樣品至少要經(jīng)過2個獨立的認證運行（qualification runs）。QC認證運行可能在同一天由多個分析人員（至少2名），或同一分析人員在不同天（至少2天）進行。建議在同一認證運行中，至少要包括3組獨立的替換批次QC樣品和至少3組現(xiàn)有批次的QC樣品。一組從單獨凍存和分裝的QC所制備的樣品被定義為一組獨立的QC樣品（一組有三個濃度級別）。在QC認證過程中，不鼓勵在同一測試運行中使用同一凍存和分裝的QC制備的一組QC。個別實驗室可以制定不同于此處建議的標準，如根據(jù)其對所涉及的變異性和風險的評估，分別進行3次獨立測試運行，而不是2次。
定量LBA方法中，替換QC批次的認證，應當以常規(guī)運行接受標準中的規(guī)定為基礎，同時也應當以其與現(xiàn)有合格QC批次的可比性（comparability）為基礎。例如，可比性標準可包括現(xiàn)有批次和替換批次之間±10%或以下的差異。使用現(xiàn)有和替換QC樣品的測量濃度，可以用下面的公式確定差異百分比值（%）。
替換批次濃度-現(xiàn)在批次濃度
用于ADA和其他非定量LBA檢測方法, 現(xiàn)有和替換的QC批次都應該滿足ADA和定性分析的常規(guī)運行接受標準。此外，現(xiàn)有和替換PCs和NCs的響應都應該在各自建立的信號范圍內(nèi)。
ii. 不存在現(xiàn)有合格（認證過的）QC批次情況下的認證
可能存在這樣的情況，即可能不存在遺留的，經(jīng)認證合格的QC樣品，因為這些QC樣品已經(jīng)用完或過期。不存在可比較QC的情況下，建議使用不同的中間原液（intermediate stocks），由不同的分析人員，分別制備兩個批次的QC樣品。從實際操作上，可以指定一個批次，可能是批量較大的，為主要批次（primary lot）；另一批次，可能是小批量的，就作為參照品（comparator），對主要批次進行認證。對主要和次要批次的對比測試應由2人進行，每人使用獨立制備的標準曲線進行測試，每人進行3次測試，至少分2天進行，總共運行6次。至少4/6 (2/3)的QC認證運行應該滿足接受標準。也應滿足上述的常規(guī)運行接受標準。兩個替換批次的QC樣品應滿足±10%或更嚴格的偏差標準，保證二者中任何一個批次均可接受。表1總結(jié)了這些認證要求。
在含有內(nèi)源性待測物的基質(zhì)中制備的QC的認證
在定量PK分析中，當基質(zhì)中含有待測物的內(nèi)源性同源物時，所測定的空白基質(zhì)濃度可能是至關(guān)重要的；并應該納入考慮。有2種方式：
1.減法：在報告測定的QC值之前，從測定的QC樣品濃度中減去空白基質(zhì)的濃度；2.加法：將測定的空白基質(zhì)濃度加上QC的外加待測物濃度，以確定其調(diào)整后的標稱值。Marcelletti等人介紹了幾個案例研究；其中，使用加法和減法，直接比較了加標回收率；這些案例研究評估了具有明顯內(nèi)源性水平的許多生物標記物的回收率。根據(jù)這些已發(fā)表的案例研究，減法是首選方法，而不推薦使用加法。建議在每個認證運行中至少包含3組空白基質(zhì)樣本，其測定的平均濃度用于調(diào)整值（adjusted value）的計算。建議對含有內(nèi)源性待測物的QC樣品，在10-20天內(nèi)至少進行30次運行，至少有2人參與，每個運行使用≥3組QC樣品。此類QC認證的運行接受標準與定量PK方法的常規(guī)運行接受標準相同。
未知標稱濃度（Nominal Concentration）的QC的認證
如果QC原液的標稱濃度未知，如未純化的蛋白質(zhì)和一些商業(yè)來源的對照原液（commercial control stocks），或者在血液學檢測中，當crude血清/血漿被用作血液因子的來源時，標稱濃度必須根據(jù)多位分析人員在不同日期進行的多次運行中檢測到的平均值來確定。
此類測試的適當規(guī)范是特異于測試方法的，必須作為研究前測試方法驗證的一部分建立起來。QC樣品的制備方法是將待測物原液，以特定稀釋倍數(shù)，加入到經(jīng)過認證（合格）的空白混合基質(zhì)或適當?shù)南♂寗╠iluent）中。對于所有成功的運行，每個QC的平均測定值就應設定為標稱值。建議至少正常實施測試運行30次，由至少2人在10-20天內(nèi)執(zhí)行，以設定QC樣品的標稱濃度。每個測試運行包含 ≥3 組QC。在最初的測定之后，日常分析運行中QC樣品的接受標準以及將來替換QC批次的接受標準為已確定的標稱值（nominal value）的±20%。任何替換批次的待測物濃度必須在此確定的范圍內(nèi)。由于來自血清和血漿的因子的固有的變異性，可能需要，基于最初的20-30次的運行數(shù)據(jù)，為每個QC濃度水平指定一個臨時的標稱值；然后，在有其它可用數(shù)據(jù)時，重新評估這個標稱值的適用性。如果測試方法的內(nèi)在變異性較大，則可能需要定期地重新評估和重新建立QC的接受范圍。前述的PK定量方法的常規(guī)運行接受標準也必須得到滿足。
標稱濃度與測定濃度單位不一致的QC的認證
酶活性測試方法是QC標稱值和測定值單位不同的方法之一。在這些分析測試中，酶類藥物的標稱(外加)濃度通常是ng/mL或?g/mL；然而，加標QC樣品測定值的活性單位為nmol/h/mL或nmol/h/?g。這些QC單位上的差異構(gòu)成了獨特的挑戰(zhàn)，因為它不能計算準確度。
在這種情況下，可以通過建立QC的標稱活性值（nominal activity value）來克服這個局限性。每個濃度級別的標稱QC活性值可以，由至少2人，根據(jù)至少30次合格運行的平均測定活性值，在至少10-20天內(nèi)建立。每次運行至少應包含3組QC樣品。所有合格運行的平均活性測定值，即為QC的標稱活性值，并可以使用下面的公式計算單個QC樣品的%RE：
其中，標稱QC活性值m30，含義是進行30次運行所測定活性的平均值。在最初的測試完成之后，日常運行和替換QC批次的接受標準就是QC活性標稱值的±20%。表2總結(jié)了上面討論的，有關(guān)特殊類別的QC樣品的注意事項。
表2. 對特殊類別QC樣品的要求的總結(jié)
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