上周，“袁來如此”專欄就LBA定量方法的監(jiān)管驗證展開了第一期詳細介紹，圍繞歷史視角、文件記錄要求、測試試劑的選擇、穩(wěn)定性、測試格式和運行/批次大?。╞atch/run size)、參照（比）物（REFERENCE MATERIAL)特異性（specificity)和選擇性（selectivity）等方面的內(nèi)容進行分享，本期將延續(xù)上期內(nèi)容，繼續(xù)分享后續(xù)相關(guān)內(nèi)容。
樣本基質(zhì)的選擇、樣本制備和最低稀釋倍數(shù)（MINIMUM REQUIRED DILUTION,MRD）選擇基質(zhì)時的考慮因素，是小分子開發(fā)的分析方法與為大分子藥物開發(fā)LBA定量分析方法之間的關(guān)鍵區(qū)別之一。小分子分析方法通常包括一個分析前的萃取步驟，該樣本前處理步驟通常有助于減輕單個基質(zhì)的變異性所帶來的問題。
而蛋白待測物的固有特性使得在樣本分析之前做萃取很難，通常是完全無法萃取。因此，通常所開發(fā)大分子定量方法無需萃取，即可測定復(fù)雜生物基質(zhì)中的待測物。然而，在可能存在內(nèi)源性蛋白待測物的情況下，必須仔細地考慮基質(zhì)的選擇和數(shù)據(jù)分析。
方法開發(fā)階段
所收集的生物樣品中的待測物存在于不同的基質(zhì)中，包括血漿、血清、尿液、腦脊液（CSF）、關(guān)節(jié)滑液和均質(zhì)化的組織。由于待測物的特性會受到樣本制備方法影響，因此必須在樣本采集過程中評估如下因素：所需要的任何添加劑（抗凝劑、蛋白酶抑制劑等）、待測物的穩(wěn)定性（血漿或血清分離前的全血）、樣本收集后的處理和儲存條件（溫度、瓶型等）。測試格式、樣本收集條件和其他因素可能會影響基質(zhì)的選擇，例如如果使用自動化樣本處理系統(tǒng)，則血清將是首選的基質(zhì)，因為血漿中通常含有血纖維蛋白凝塊，可能會干擾移液操作。相比之下，血漿是不穩(wěn)定待測物的首選基質(zhì)，因為制備血清所需的時間較長，而且存在蛋白水解酶（proteolytic enzyme）降解蛋白的問題。本文稍后將對樣本收集后基質(zhì)中的待測物進行更確切的穩(wěn)定性評估。加標樣品（spiked sample）的基質(zhì)應(yīng)當與預(yù)期的未知研究樣本的基質(zhì)相同，要使用相同的基質(zhì)制備標準品（標/校準品，standard/calibrator）。當在基質(zhì)中檢測不到內(nèi)源性信號時，簡單地加標/回收研究就足以確定合適的空白基質(zhì)。在這些條件下，建議使用標稱濃度（nominal concentration）。相反，當基質(zhì)中存在可定量的內(nèi)源性物質(zhì)，并且內(nèi)源性物質(zhì)和外加待測物的回收率是累加式（線性）的時候，可以應(yīng)用一個校正因子（例如內(nèi)源性濃度4ng/mL，加標分析物為6ng/mL，累加效應(yīng)為10ng/mL）。在這種情況下，可將所測定的內(nèi)源性濃度與所添加的待測物濃度（標稱值）相加來得到指定值（assigned value）（表IIA和表IIB）。表IIA.內(nèi)源性蛋白累加貢獻效應(yīng)的示例。在這種情況下，內(nèi)源性蛋白的影響可以在低質(zhì)量對照樣品（QC）中觀察到；但其對中、高水平質(zhì)量對照樣品的影響不大。
表IIB. 當?shù)润w積的基質(zhì)和QC加在一起時，內(nèi)源性蛋白累加（線性）貢獻的示例。方法：50mL含內(nèi)源性藥物的基質(zhì)（25.7U/L）+ 50mL 標準品10（10U/L）= 期望值17.9U/L（相互以1：2的比例稀釋：12.85U/L+ 5U/L= 17.85U/L）
另一種選擇是減去內(nèi)源性濃度，該濃度是用正在驗證的分析方法或一個正交的（orthogonal）分析方法所測定的。這種方法需要分析空白樣品（另外加待測物），這樣就可以減去內(nèi)源量，并計算出外加的標稱量。當內(nèi)源性濃度和外加的待測物濃度不是線性關(guān)系時，就不能用數(shù)學方法將這兩個濃度相加，因而只能報告測定的（觀察到的）濃度（表IIC）。或者可以在外加待測物之前，剝離空白基質(zhì)中內(nèi)源性蛋白。
表IIC. 內(nèi)源性蛋白非線性貢獻的例子。觀察到的藥物濃度與“空白”基質(zhì)中的內(nèi)源藥物量或外加的“目標”濃度均不是線性相關(guān)。在這種情況下，觀察到（測定）的濃度是唯一可以放心使用的數(shù)值。
通常不推薦使用剝離了內(nèi)源物的基質(zhì)或替代基質(zhì)，但在無法設(shè)計其它策略來定量內(nèi)源物時，則是必要的。使用木碳（charcoal）剝離的基質(zhì)，很難保證基質(zhì)的其它方面不發(fā)生變化。如果使用配體親和層析剝離內(nèi)源物，配體的溶出可能會干擾該分析方法。無論基質(zhì)干擾的來源如何，制備QC樣品時，必須使用與研究樣本類型一致的、純粹且未改變的基質(zhì)。除了保證待測物的穩(wěn)定性外，在純粹基質(zhì)（neat matrix）中制備QC樣品還可用于同時測定分析方法的精密度和準確性。
當難以獲得生物基質(zhì)（例如關(guān)節(jié)滑液、腦脊液）時，可以用一個替代基質(zhì)（substitute matrix）來制備標準曲線。應(yīng)嘗試使用真實樣本基質(zhì)制備至少一個級別的QC樣品，以證實基質(zhì)效應(yīng)沒有影響準確度，即沒有均值偏差（mean bias）。分析方法所需的最小稀釋倍數(shù)（MRD）是必須稀釋樣本的最小稀釋倍數(shù)，是為了在分析時使用規(guī)定的標準品和樣本稀釋液，以達到最優(yōu)的準確度和精密度。在某些情況下，如當標準品是在100%的血清或血漿中制備時，則不存在MRD，可以直接分析未稀釋的純粹樣本。在其它情況下，如果內(nèi)源性物質(zhì)沒有產(chǎn)生線性信號或觀察到的背景信號不是由于內(nèi)源性的分析物（例如，heterophilic antibodies，風濕因子）增加影響的，則可能需要稀釋樣本，以建立可接受的線性關(guān)系。為了克服信噪比的問題，所有的樣本都必須以某個倍數(shù)進行最低限度的稀釋，以取得更高的重現(xiàn)性和準確度。研究前驗證階段
在方法開發(fā)過程中所選擇的生物基質(zhì)將用于制備研究前驗證所用的標準品和驗證樣品。一旦在方法開發(fā)過程中解決了基質(zhì)的影響，就不需要進一步的驗證，但驗證報告中應(yīng)該包括對該解決方法的討論。如果使用的是經(jīng)過剝離的基質(zhì)，驗證樣品則必須在同樣的基質(zhì)中制備，以評估精密度和準確性。在方法開發(fā)過程中選擇的MRD也將在研究前驗證中得到確認。研究中驗證階段
在研究中驗證時，除了在觀察到基質(zhì)干擾時需要額外稀釋樣本外，沒有與樣本制備相關(guān)的接受標準。由于潛在的基質(zhì)干擾而導致重新分析樣品時，應(yīng)當預(yù)先設(shè)定并常規(guī)地應(yīng)用相關(guān)指導原則。在基質(zhì)批次變化的情況下，應(yīng)當制備相同濃度的QC樣品，證實與研究前驗證數(shù)據(jù)的可比性，然后繼續(xù)進行樣本分析。標準校準物（STANDARD CALIBARTOR)和標準曲線將已知數(shù)量表征良好的標準參照（比）物（待測物，analyte）加入到適當?shù)幕|(zhì)中制備標準校準品，在既定的分析條件下生成并得到濃度-響應(yīng)關(guān)系，即標（校）準曲線（standard curve）。根據(jù)這個標（校）準曲線，未知樣品中分析物的濃度可以通過內(nèi)插方法計算。在方法開發(fā)過程中，應(yīng)當建立標準品的濃度和將一條曲線擬合于校準數(shù)據(jù)的回歸模型，此模型需在研究前驗證期間得到確認，并在分析研究樣本時使用。表III匯總了評估標準曲線數(shù)據(jù)設(shè)計和分析回歸模型的建議，將使用表IV中的研究前驗證的標準曲線數(shù)據(jù)說明統(tǒng)計分析的過程。表III. 標準曲線評定標準. （未包括“錨定點”）
表IV.一個研究前驗證的標準曲線響應(yīng)值
方法開發(fā)階段
由于標準點濃度在方法驗證開始后不應(yīng)改變，因此在方法開發(fā)過程中應(yīng)包括更多的標準點（standard point）和重復(fù)點（replicates），以便盡早地詳細研究濃度-響應(yīng)關(guān)系，盡可能地實現(xiàn)為回歸模型提供可靠的評估。標準參照（比）物濃度點的范圍應(yīng)包括稀釋后研究樣品的濃度，并在對數(shù)刻度上近似均勻地間隔。建議至少有10個非零標準濃度點（復(fù)孔，duplicate）用于濃度-響應(yīng)關(guān)系，用于其早期特征的描述。該濃度-響應(yīng)關(guān)系可以使用4/5參數(shù)的logistic函數(shù)（4/5PL 模型）來描述。標準曲線應(yīng)擬合校準濃度點的平均響應(yīng)值（圖1A）。圖1. A.5參數(shù)logistic (5PL)加權(quán)非線性最小二乘法回歸擬合的曲線。平均響應(yīng)是表IV.中列出了第6個運行（batch）的重復(fù)結(jié)果。B.圖1A中回算標準點濃度的百分比相對誤差。所有數(shù)值都在標稱值的10%以內(nèi)。
擬合曲線時，對平均響應(yīng)值是否加權(quán)的問題，應(yīng)通過對復(fù)孔數(shù)值的標準方差與不同濃度點的平均值之間的關(guān)系來評估決定。例如，表IV中標準校準點濃度的混合標準方差與平均響應(yīng)的關(guān)系圖在對數(shù)刻度上顯示了一個線性增加的關(guān)系（圖2）。在這種情況下，加權(quán)擬合通常比不加權(quán)更合適。在考慮刪除復(fù)孔值的標準時，有關(guān)復(fù)孔值變異性的信息會非常有用。
表IV.一個研究前驗證的標準曲線響應(yīng)值
圖2. 表IV所列標準曲線吸光度值的混合運行（batch）內(nèi)標準方差與累積平均響應(yīng)之間的關(guān)系。每個點代表一個濃度點的平均值和通過方差分析（ANOVA）計算的標準方差。在高吸光度水平下，變異性較大；這表明，在擬合標準曲線時，加權(quán)可能是適當?shù)摹?/span>
在建立校準模型時，建議分析至少3個獨立運行（batch/run）的標準曲線濃度-響應(yīng)數(shù)據(jù)，每次運行應(yīng)包含兩條標準曲線，以便評估運行內(nèi)標準曲線的可重復(fù)性。模型的適宜性取決于標準點回算濃度的RE，計算一個濃度點的RE如下：從回算濃度中減去標稱濃度并將其差值除以標稱濃度。通常，對于曲線內(nèi)的大多數(shù)標準點回算濃度的絕對RE應(yīng)為20%。例如，根據(jù)加權(quán)5PL回歸曲線擬合平均光吸收值（表IV中第6個運行的數(shù)據(jù)）所得出的模型，回算濃度的絕對REs都是<10%（表V和圖1B）。同樣，其他5個運行的絕對REs也始終一致地<10%（第1個運行中的幾個點除外）。
表 V. 對于表IV中數(shù)據(jù)的平均響應(yīng)，回算的標準濃度的百分比相對誤差 (%RE)
一個可被接受的校準模型，其曲線的累積回算數(shù)值對于在預(yù)期的定量范圍內(nèi)的所有濃度，應(yīng)具有10%的絕對平均RE值和15%的變異系數(shù)（CV）（參見表V）。在校準品濃度范圍中，如果平均RE存在一個趨勢，即回算濃度始終一致地高于或低于標稱濃度，則是擬合失敗的證據(jù)，會使該模型失效。擬合失敗可能是由于選擇了不合適的平均值函數(shù)（例如，在濃度-響應(yīng)曲線不對稱時使用了4PL函數(shù)）或加權(quán)過程不當。例如，加權(quán)使得擬合的曲線與表IV中的數(shù)據(jù)更相符，其證據(jù)是：在較低濃度部分，降低了平均RE(圖3A)和CV(圖3B)；而在較高濃度部分，準確性或精密度的損失極小。圖3. A.未加權(quán)和加權(quán)五參數(shù)logistic(5PL)回歸曲線回算濃度的累積平均相對誤差百分比的比較與表IV的吸光度數(shù)據(jù)相吻合。加權(quán)模型的結(jié)果在整個標準濃度范圍是可以接受的，而非加權(quán)模型在低于1000pg/mL濃度是不可接受的。B.未加權(quán)和加權(quán)五參數(shù)logistic (5PL)回歸曲線回算濃度變化的累積百分比系數(shù)的比較與表IV的吸光度數(shù)據(jù)相吻合。加權(quán)回歸模型的計算值總結(jié)如下在表V中。加權(quán)模型在較低濃度水平下得到了較小的批間變化系數(shù)。
表IV.一個研究前驗證的標準曲線響應(yīng)值
表 V. 對于表IV中數(shù)據(jù)的平均響應(yīng)，回算的標準濃度的百分比相對誤差 (%RE)
研究前驗證階段
對研究前驗證所需的標準校準品，應(yīng)根據(jù)方法開發(fā)過程中獲得的性能信息來制備。通常，對于使用4/5PL函數(shù)來擬合的濃度-響應(yīng)關(guān)系，在預(yù)期的濃度范圍內(nèi)，應(yīng)至少包括6個非零、復(fù)孔校準點，這些校準點應(yīng)在對數(shù)刻度上近似均勻地間隔。為了改善曲線擬合，可以包括定量范圍之外的錨定點或校準點。
在方法開發(fā)過程中建立的回歸模型應(yīng)在至少6個獨立的研究前驗證運行中得到確認，通常也在相同的運行中評估方法的精密度和準確度。在一個運行中接受標準曲線時，回算濃度值（至少為75%，不包括錨定點和校準點）的%RE應(yīng)在標稱濃度的20% 以內(nèi)（對于LLOQ，%RE應(yīng)在25%以內(nèi)）。驗證結(jié)束時，應(yīng)為每個校準點計算所有運行的累計平均%RE和%CV，如果每一個標準點（不包括錨定點）的RE和CV均為15%，則回歸模型是可以接受的；在LLOQ，%RE和%CV應(yīng)為20%。應(yīng)當在報告驗證樣品的分析結(jié)果之前確認回歸模型。由于可確定的原因造成了技術(shù)誤差（如，移液誤差），或可通過應(yīng)用a priori統(tǒng)計標準編輯標準曲線，屏蔽某些校準點。
研究中驗證階段
對每個研究中的測試運行，應(yīng)使用與研究前驗證相同的標準，監(jiān)測標準曲線和編輯標準曲線中某個校準點。標準曲線的編輯必須獨立于QC，并于評估QC樣品的性能之前完成。編輯后剩余的校準點的最終數(shù)量必須≥總校準點的75%；或者除錨定點外，至少有6個校準點。如果刪除高（ULOQ）或低校準點（LLOQ）中的任何一個，這個運行的定量范圍將被限制在下一個校準點，所以，必須重新分析超出定量范圍的樣本。本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備，歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。
