上周，“袁來(lái)如此”專欄正式開篇，博濟(jì)醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士以《大分子生物分析概論（一）：大分子藥物生物分析的基礎(chǔ)知識(shí)》為題，梳理了大分子藥物分析方法的基礎(chǔ)概念。
本期開始，“袁來(lái)如此”專欄將就LBA定量方法的監(jiān)管驗(yàn)證展開詳細(xì)介紹，預(yù)計(jì)將有多篇重磅干貨內(nèi)容呈現(xiàn)，敬請(qǐng)垂注！
1992年，美國(guó)弗吉尼亞州水晶城，全球首個(gè)關(guān)于生物分析方法驗(yàn)證會(huì)議召開，會(huì)議討論共識(shí)的生物利用度、生物等效性和藥代動(dòng)力學(xué)研究的生物分析方法成為了后來(lái)制藥行業(yè)進(jìn)行生物分析方法驗(yàn)證的實(shí)際準(zhǔn)則。史稱水晶城會(huì)議。
水晶城會(huì)議還討論了生物分析方法驗(yàn)證的普遍問(wèn)題，同時(shí)也承認(rèn)了色譜和非色譜測(cè)試方法（包括免疫測(cè)試方法和微生物方法）之間存在差異。以水晶城會(huì)議為基礎(chǔ)，后續(xù)的行業(yè)會(huì)議和文獻(xiàn)對(duì)生物分析方法驗(yàn)證進(jìn)行了多次討論。
迄今為止，人們最重視的是常規(guī)小分子藥物的生物分析方法的驗(yàn)證，其主要原因是自從1990年以來(lái)，作為小分子藥物的常規(guī)分析工具——串聯(lián)式液相色譜-質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）的使用率在迅速地增長(zhǎng)。而大分子的生物分析方法亦對(duì)此借鑒頗多。
在本文中，LBA 是免疫測(cè)試方法（immunoassays）的同義詞，指任何基于大分子相互作用進(jìn)行定量分析的方法；監(jiān)管驗(yàn)證（regulatory validation）則是通過(guò)驗(yàn)證后方法所產(chǎn)生的分析數(shù)據(jù)，可供生物藥物的臨床前毒理研究和臨床申報(bào)、注冊(cè)使用。后續(xù)文章將詳細(xì)解釋監(jiān)管驗(yàn)證與非監(jiān)管驗(yàn)證之間的差異，敬請(qǐng)關(guān)注。
一個(gè)分析方法的生命周期通常可分為3個(gè)階段：方法開發(fā)（method development）、研究前驗(yàn)證（pre-study validation）和研究中驗(yàn)證（in-study validation）。方法開發(fā)是建立分析方法的過(guò)程，而研究前驗(yàn)證是對(duì)分析方法的確認(rèn)，研究中驗(yàn)證則是在應(yīng)用過(guò)程中，如出現(xiàn)關(guān)鍵成分發(fā)生變化后，進(jìn)行的部分驗(yàn)證。
為了確保一個(gè)分析方法能用于大分子定量，以支持藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估，并經(jīng)得起監(jiān)管審核，需要對(duì)特定分析方法的各個(gè)組成部分進(jìn)行評(píng)估、驗(yàn)證和持續(xù)監(jiān)控。因此，只要使用該分析方法，其驗(yàn)證就是一個(gè)持續(xù)的過(guò)程。
所以，方法驗(yàn)證是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程。表1總結(jié)了需要評(píng)估的組分和對(duì)于分析方法生命周期中每個(gè)階段的建議。本文的組織也對(duì)應(yīng)于這些方法組分，在相應(yīng)的章節(jié)中，將討論在不同階段中可能開展的活動(dòng)的更完整、詳信的信息。
表1. 驗(yàn)證評(píng)估參數(shù)匯總
方法開發(fā)階段
在方法開發(fā)過(guò)程中生成的信息應(yīng)記錄在實(shí)驗(yàn)室筆記本或其他可接受的文檔形式中。應(yīng)包括以下評(píng)估信息：關(guān)鍵檢測(cè)試劑的選擇和穩(wěn)定性、測(cè)試格式的選擇（抗體、稀釋液、微孔板、檢測(cè)系統(tǒng)等）、標(biāo)準(zhǔn)曲線模型的選擇、樣本基質(zhì)的選擇、試劑的特異性、樣本制備、初步的穩(wěn)定性研究和方法穩(wěn)健性（robustness）的初步評(píng)估。在方法開發(fā)階段結(jié)束時(shí)，應(yīng)生成方法草案或方法驗(yàn)證工作列表（即需要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)），供研究前驗(yàn)證期間參考。
研究前驗(yàn)證階段
在開始研究前驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)撰寫一個(gè)方法驗(yàn)證計(jì)劃或者是可以參考適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)操作程序 （SOP），以確保研究前驗(yàn)證所需要做的實(shí)驗(yàn)有一個(gè)書面大綱。此驗(yàn)證計(jì)劃可以是一個(gè)獨(dú)立的文檔，也可以是實(shí)驗(yàn)室記錄本或類似文檔的一部分。該文件應(yīng)包括對(duì)此方法預(yù)期用途的描述以及需要驗(yàn)證的性能參數(shù)，這些參數(shù)包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和準(zhǔn)確性、定量范圍、特異性和選擇性、穩(wěn)定性、稀釋線性、穩(wěn)健性、運(yùn)行大?。ㄅ蝏atch/run size）和運(yùn)行接受標(biāo)準(zhǔn)。該驗(yàn)證計(jì)劃應(yīng)包括擬進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)工作所研究的每個(gè)性能參數(shù)的目標(biāo)接受標(biāo)準(zhǔn)。完成驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)撰寫一份全面的報(bào)告，報(bào)告的格式可以由實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部政策決定，此報(bào)告應(yīng)匯總測(cè)試性能數(shù)據(jù)、涉及方法SOP或驗(yàn)證計(jì)劃的偏差以及任何其他相關(guān)信息。研究中驗(yàn)證階段
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究人員需要生成包含適當(dāng)統(tǒng)計(jì)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量控制樣品（QC）的累積數(shù)據(jù)匯總表，并將其與研究樣本的測(cè)定數(shù)值匯總到最終的研究報(bào)告中。與研究前驗(yàn)證不同的是，這些表格中不包括失敗的運(yùn)行。最終報(bào)告中需包含的其他信息包括：分析過(guò)程中發(fā)生的偏差描述、重復(fù)分析的樣本匯總及其原因以及所有未通過(guò)運(yùn)行的詳細(xì)信息的匯總表。4.測(cè)試試劑的選擇、穩(wěn)定性、測(cè)試格式和運(yùn)行/批次大?。╞atch/run size)LBA分析方法的關(guān)鍵組成部分是配體試劑（ligand reagent），通常是用于免疫測(cè)試的一個(gè)或一對(duì)抗體。此外，其他配體試劑還可能包括結(jié)合蛋白（binding protein）、受體（receptor）、寡核苷酸（oligonucleotide）和多肽片段。為簡(jiǎn)單起見，本文僅討論免疫測(cè)試用的試劑（必須選擇擁有適當(dāng)特異性和選擇性試劑，其應(yīng)當(dāng)具有能夠持久且穩(wěn)定地形成抗體/抗原復(fù)合物的結(jié)合特性）。LBA的測(cè)試格式包括但不限于：夾心式、競(jìng)爭(zhēng)式、直接或間接結(jié)合抑制以及固相或溶液相的測(cè)試格式。一個(gè)典型的測(cè)試運(yùn)行（batch/run）包含了標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)樣品（standard calibrator）、驗(yàn)證樣品（validation sample）、QC 樣品和研究樣本（study sample），在應(yīng)用要驗(yàn)證的方法時(shí)須將它們作為整體進(jìn)行分析。在理想狀況下，所需最低數(shù)量的QC樣品應(yīng)代表給定運(yùn)行中研究樣本總數(shù)的5%。對(duì)于基于微孔板的測(cè)試方法，一個(gè)運(yùn)行可以包括多個(gè)獨(dú)立的微孔板，但每個(gè)微孔板應(yīng)包含獨(dú)立的一組校準(zhǔn)樣品和QC樣品。
方法開發(fā)階段
方法開發(fā)的第一步是選擇測(cè)試格式。對(duì)于固相測(cè)試，必須選擇固定抗體或其他蛋白質(zhì)。如受體的固相，常為塑料和玻璃表面，但二者之間的差異可能很大，還會(huì)影響方法的靈敏度和變異性。如果使用主動(dòng)吸附（active adsorption，例如avidin-biotin），則必須選擇用于改變固相表面（包板）的合適的化學(xué)反應(yīng)。被動(dòng)吸附（passive adsorption）是最常用的包板方法，但會(huì)受到所使用的緩沖液特性（例如鹽濃度和pH）的影響，必須適當(dāng)?shù)剡x擇包板溶液的濃度/體積、混合蛋白質(zhì)的模式（搖動(dòng)與渦旋）和包板的溫度。在選擇測(cè)試稀釋液時(shí)，必須考慮待測(cè)物、預(yù)期的基質(zhì)和結(jié)合實(shí)體（例如抗體或受體）的具體特征。例如，可能需要添加重金屬或螯合劑，以便確認(rèn)達(dá)到最佳的結(jié)合狀態(tài)。此外，還可能需要考慮去污劑（例如，Tween-20或Triton-X100）或填充蛋白（如albumin,casein或gelatin），從而優(yōu)化測(cè)試方法的性能。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)選擇合適的信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，以提供可接受的信號(hào)并使背景噪聲最小化。使用比色法（colorimetry）以外的信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，可以提高檢測(cè)的靈敏度。這些檢測(cè)信號(hào)系統(tǒng)包括熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性測(cè)定和電化學(xué)發(fā)光。使用信號(hào)放大系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度。除了分析方法的各個(gè)組分外，在方法開發(fā)過(guò)程中，還應(yīng)當(dāng)選擇、建立和運(yùn)行該分析方法的格式，如競(jìng)爭(zhēng)式或非競(jìng)爭(zhēng)式。
應(yīng)當(dāng)建立分析配置（assay configuration，例如標(biāo)準(zhǔn)品、QC樣品和研究樣本在微孔板上的位置），并測(cè)試與預(yù)期的研究中測(cè)試運(yùn)行相同數(shù)量的微孔板。應(yīng)當(dāng)根據(jù)測(cè)試方法的性能與所需的測(cè)試精密度之間的關(guān)系來(lái)確定用于標(biāo)準(zhǔn)品、QC樣品和研究樣本的重復(fù)孔數(shù)量。雖然最終結(jié)果可以基于單孔或復(fù)孔的分析結(jié)果，但確定QC樣品結(jié)果的重復(fù)孔數(shù)量必須與用于獲取真實(shí)樣本結(jié)果的重復(fù)孔數(shù)量相同。
對(duì)運(yùn)行內(nèi)（intra-batch/run）和運(yùn)行間（inter-batch/run）測(cè)試性能的評(píng)估，需要為每個(gè)驗(yàn)證樣本生成多個(gè)結(jié)果，其中每個(gè)結(jié)果都是根據(jù)重復(fù)孔的響應(yīng)值計(jì)算的。測(cè)試運(yùn)行的數(shù)量和每個(gè)樣本的重復(fù)孔結(jié)果（即重復(fù)測(cè)量結(jié)果）的數(shù)量應(yīng)足夠大，從而可靠地估計(jì)該測(cè)試方法的性能特征。稍后在涉及特定性能特征（例如，精密度和準(zhǔn)確性）的部分中，將提出有關(guān)最少測(cè)試運(yùn)行/重復(fù)孔數(shù)量的建議。
研究前驗(yàn)證階段
在方法驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用在方法開發(fā)階段識(shí)別和優(yōu)化了的關(guān)鍵測(cè)試試劑（簡(jiǎn)稱關(guān)鍵試劑），且不能更改，并在方法SOP中予以標(biāo)識(shí)。在方法驗(yàn)證的過(guò)程中，將確認(rèn)方法草案中定義的這些關(guān)鍵試劑的性能。還應(yīng)當(dāng)確認(rèn)分析配置（如微孔板數(shù)量、標(biāo)準(zhǔn)品和驗(yàn)證樣品的位置、重復(fù)孔數(shù)量、操作條件等）以及在方法開發(fā)過(guò)程中確定的測(cè)試運(yùn)行的大小（batch/run size）。研究中驗(yàn)證階段
在測(cè)試方法的生命周期中，通常需要更換某個(gè)關(guān)鍵組分（例如試劑批次）。對(duì)已驗(yàn)證組分的更改，需要進(jìn)行部分驗(yàn)證，來(lái)證明其具有類似的性能。此外，還可以使用在常規(guī)分析運(yùn)行中QC樣品產(chǎn)生的可接受結(jié)果，來(lái)延長(zhǎng)關(guān)鍵試劑（不包括參考標(biāo)準(zhǔn)，reference standard）的有效期，并且必須根據(jù)這些數(shù)據(jù)，仔細(xì)記錄有效期的延長(zhǎng)。在研究中驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用之前驗(yàn)證過(guò)的測(cè)試格式，對(duì)此格式的任何更改均應(yīng)清晰地記錄在案。如果進(jìn)行了重大更改，則可能需要進(jìn)行部分驗(yàn)證，以證明測(cè)試性能的可比性。5.參照（比）物（REFERENCE MATERIAL)用于制備標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)品（standard calibrator）、驗(yàn)證樣品和QC樣品的物料來(lái)源會(huì)有所不同。須著重了解物料的來(lái)源及相關(guān)說(shuō)明材料。在條件允許的情況下，盡可能地將標(biāo)準(zhǔn)品、驗(yàn)證樣品、QC樣品等從同一來(lái)源物料的單獨(dú)分裝（separate aliquot）小份中制備。參照（比）物在供應(yīng)有限的情況下（例如，藥物相互作用研究，其中純標(biāo)準(zhǔn)品只能從商業(yè)試劑盒這樣的有限來(lái)源獲得），可以通過(guò)考查不同批次或其他商業(yè)商品之間的可比性后，從同一個(gè)單個(gè)等分（single aliquot）物料中制備標(biāo)準(zhǔn)品和QC樣品。6.特異性（specificity)和選擇性（selectivity）抗體的特異性（specificity）是指其結(jié)合目標(biāo)抗原的能力。在理想的情況下，所使用的抗體對(duì)待測(cè)物是特異性的，即不與樣品中可能存在的待測(cè)物的變異體，或其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)。特異性有時(shí)與交叉反應(yīng)性的概念有關(guān)，如果抗體是高度特異性的，則其交叉反應(yīng)性較低。
選擇性（selectivity）是一個(gè)與特異性有關(guān)的概念，是一種分析方法在樣本中存在其他成分的情況下檢測(cè)待測(cè)物的能力。通常，LBA無(wú)需樣品預(yù)處理（例如萃?。芍苯釉谏锘|(zhì)中測(cè)定待測(cè)物的濃度，但此做法或?qū)⑹艿皆噭┡c樣本基質(zhì)成分的交叉反應(yīng)所引起的非特異性反應(yīng)的影響。特異性和選擇性評(píng)估將驗(yàn)證該分析方法是否對(duì)待測(cè)物具有特異性，并且可以從復(fù)雜的基質(zhì)中選擇性地定量待測(cè)物，而不被正向或負(fù)向的干擾所影響。
方法開發(fā)階段
分析方法的特異性將取決于所使用的抗體或抗體對(duì)（antibody pair）的預(yù)先確定的特異性?？贵w可以從商業(yè)來(lái)源獲得或內(nèi)部生產(chǎn)。無(wú)論哪種情況，在選擇之前都必須評(píng)估抗體結(jié)合特性的數(shù)據(jù)，評(píng)估分析特異性的方法通常是分析樣本基質(zhì)，樣品基質(zhì)+不同濃度的待測(cè)物及其變異體、物理化學(xué)上類似的化合物以及樣品基質(zhì)+可能與待測(cè)物共同使用的化合物。
在某些情況下，可以使用一個(gè)樣本基質(zhì)來(lái)評(píng)估特異性，該樣本基質(zhì)包含與體內(nèi)濃度相當(dāng)?shù)囊环N或多種與待測(cè)物有關(guān)的化合物。通常，競(jìng)爭(zhēng)式測(cè)試格式比夾心式測(cè)試格式更易受干擾物的干擾，因?yàn)閵A心式分析方法使用兩種抗體，故具有更大的特異性。
如果無(wú)法獲得待測(cè)物的變異體或相關(guān)形式，則可能無(wú)法在方法開發(fā)過(guò)程中生成交叉反應(yīng)性（分析特異性assay specificity）數(shù)據(jù)。因此，可能需要對(duì)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的分析方法的特異性進(jìn)行回顧性評(píng)估，因?yàn)殡S著時(shí)間的流逝，將產(chǎn)生更多有關(guān)待測(cè)物行為的數(shù)據(jù)。
在方法開發(fā)過(guò)程中，評(píng)估選擇性即是評(píng)估存在基質(zhì)成分時(shí)對(duì)待測(cè)物的定量。這些基質(zhì)成分可能會(huì)干擾抗體與待測(cè)物的結(jié)合，應(yīng)當(dāng)在定量下限（LLOQ，即低于低水平QC樣品的濃度）或之上的附近外加待測(cè)物到同一樣本基質(zhì)類型的多個(gè)批次(至少10個(gè))中，并評(píng)估相對(duì)誤差的百分比（%RE）。盡管選擇性問(wèn)題通常在定量范圍的低端發(fā)生，也需要在較高待測(cè)物濃度下評(píng)估選擇性。在背景干擾與濃度有關(guān)的情況下，必須確定在哪個(gè)待測(cè)物的濃度之下可能出現(xiàn)干擾。在方法驗(yàn)證之前，可能需要相應(yīng)地提升最低的定量限。
研究前驗(yàn)證階段
研究前的驗(yàn)證過(guò)程將證實(shí)分析方法的特異性和選擇性性能（使用最相關(guān)的化合物和樣本基質(zhì)）。選擇性由回收率（recovery）代表，回收率的接受標(biāo)準(zhǔn)與準(zhǔn)確性評(píng)估相同。推薦的選擇性接受標(biāo)準(zhǔn)是：至少80％被評(píng)估的樣本基質(zhì)均獲得可接受的回收率。研究中驗(yàn)證階段
在樣本分析過(guò)程中，通常不存在針對(duì)特異性和選擇性的接受標(biāo)準(zhǔn)。如果存在潛在的干擾問(wèn)題，則必須事先確定樣本的性能特征，并做相應(yīng)的處理。通常情況下，疾病狀態(tài)的樣本基質(zhì)可能包含對(duì)照基質(zhì)中不存在的成分，例如，類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor）脫落的可溶性受體，來(lái)自自身免疫性疾病的異源干擾、高血脂（lipemic）樣本、溶血（hemolyzed）樣本等。因此，強(qiáng)烈建議在獲得相關(guān)疾病狀態(tài)的樣本基質(zhì)后，重復(fù)進(jìn)行選擇性和特異性實(shí)驗(yàn)。更換抗體批次后，也需要重新驗(yàn)證特異性和選擇性。本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來(lái)自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備，歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
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袁來(lái)如此｜大分子生物分析概論（一）：大分子藥物生物分析的基礎(chǔ)知識(shí)
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