隨著國家鼓勵新藥研發(fā)、藥品審評審批制度改革的快速推進，化藥注冊分類、上市許可持有人制度等重磅政策的陸續(xù)出臺，我國新藥研發(fā)迎來暖春。對于力圖在創(chuàng)新藥領(lǐng)域深耕的從業(yè)者而言，如何洞悉全局，乘勢而為，或?qū)⒊蔀槲磥沓蓴〉年P(guān)鍵。
為此，廣州博濟醫(yī)藥微信公眾號特邀生物分析專家、博濟醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士，開設(shè)“袁來如此”專欄，就大分子生物分析、藥代動力學(xué)等相關(guān)話題展開專題研究，希望通過相關(guān)知識與經(jīng)驗的分享，引發(fā)更多讀者的討論交流，加速振興中國的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展，敬請垂注！
本文為“袁來如此”專欄的第一篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻資料，對與大分子生物分析相關(guān)的知識進行系統(tǒng)地介紹。
配體結(jié)合式測試方法（LBA，也稱為immunoassays）是一種常用的分析工具，用于根據(jù)與其他生物分子的相互結(jié)合作用（binding interaction），定量測定生物分子（目標分析物，Analyte）在生物體液中的濃度。LBA要求至少使用一個生物分子來定量目標分析物，這個生物分子通常被稱為關(guān)鍵試劑，須能夠特異性地結(jié)合目標分析物。
LBA可分為兩大類：（1）液相結(jié)合測試，其目標分析物與標記過的檢測試劑之間的結(jié)合反應(yīng)發(fā)生在溶液相（圖1A）；（2）固相結(jié)合測試，其中一個關(guān)鍵試劑被固定到固體表面，如微孔板或樹脂（圖1B），以捕獲樣本中的目標分析物。液相測試通常需要分離步驟，如色譜或電泳或離心，從而將目標分析物-標記檢測試劑從未結(jié)合的分子中分離出來進行定量。
在應(yīng)用上，LBA是重要的評估生物藥PK/TK時的主要定量分析方法之一，該方法的特異性和選擇性取決于目標分析物與其他生物分子（如受體、針對候選生物藥的抗體和核酸適配體（aptamer））的相互作用。
該方法中可觀察到儀器響應(yīng)與生物藥的濃度間接相關(guān)，簡言之，檢測信號的來源是酶化學(xué)反應(yīng)或放射化學(xué)反應(yīng)，而這些反應(yīng)則是各種相互結(jié)合作用（binding interactions）的一部分。
一般而言，大分子的物理化學(xué)特性無法直接產(chǎn)生檢測信號，不能用于這樣的定量分析方法。主要原因在于這些binding interactions的內(nèi)在性質(zhì)，LBA的標（校）準曲線的動態(tài)（定量）范圍比較狹窄，同時也是非線性，S型的（sigmoidal curve）。
如圖1所示，在液相測試中，結(jié)合反應(yīng)在溶液中發(fā)生，其中一個目標分析物與標記過的檢測試劑結(jié)合，然后再通過后續(xù)的分離操作將目標分析物-標記檢測試劑從未結(jié)合的分子中分離出來。
在固相測試中，一個關(guān)鍵試劑被固定到固體表面，如微孔板或樹脂，此試劑在固體表面結(jié)合目標分析物，從而致使未結(jié)合的分子被分離出來。
Yalow和 Benson于1960年開發(fā)的測定人類胰島素的方法，是放射免疫測定（RIA）的標志性例子，Yalow因此于1977年獲得諾貝爾獎。簡單地說，就是通過用魚精蛋白鋅牛胰島素或商業(yè)常規(guī)牛胰島素免疫豚鼠，以獲得作為該RIA方法關(guān)鍵試劑的胰島素結(jié)合抗體。
在這種方法中，由于缺乏人類胰島素的結(jié)晶體，因此I131標記的結(jié)晶牛胰島素（胰島素-I131）被用作示蹤劑。此 RIA 的原理是基于樣本中的人胰島素與豚鼠血清中的胰島素結(jié)合抗體的強力結(jié)合（圖2中的步驟1），并讓已知濃度的胰島素-I131與該抗體的結(jié)合競爭（圖2步驟2-3）。胰島素-I131與胰島素結(jié)合抗體的結(jié)合在溶液中進行，游離的胰島素-I131與結(jié)合了抗體的胰島素-I131的分離通過紙色譜電泳技術(shù)實現(xiàn)，這就使得定量測定胰島素-I131成為可能，其代表了樣本中胰島素的濃度。在此方法中，最低可定量的胰島素濃度為1.4μU。
在這個有里程碑意義的研究發(fā)表之后，RIA在20世紀后期得到了廣泛的應(yīng)用。在使用適當?shù)年P(guān)鍵試劑時，RIA靈敏度和選擇性都極高，而其主要挑戰(zhàn)包括使用和處置放射性材料的許可證要求、放射性同位素的標記效率、成本及其有限的半衰期。在RIA得到應(yīng)用的十年內(nèi)，即20世紀的70年代初，就出現(xiàn)了非同位素免疫測定，如酶免疫測定（enzyme immunoassays，EIA），EIA通常被稱為ELISA，即酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay）。
Engvall和Perlmann在1971年首次描述了一個定量兔免疫球蛋白G（兔IgG）的ELISA方法。其實質(zhì)就是從羊血清中提取的抗兔IgG用于結(jié)合兔子IgG，進而結(jié)合了一種堿性磷酸酶（ALP）的兔IgG被用來與兔IgG相互競爭和抗兔IgG血清的結(jié)合，以此建立濃度與儀器響應(yīng)（信號）之間的關(guān)系，生成的儀器信號與樣本中的IgG量成反比。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，學(xué)界運用了不同的酶，如辣根過氧化物酶（HRP）、β-半乳糖苷酶（GAL）和熒光素酶（luciferase），使得EIA具有與RIA相當?shù)撵`敏度。
圖 2. Yalow最初發(fā)明的胰島素放射免疫測定的原理圖。樣本中的胰島素在溶液中與抗胰島素血清結(jié)合（步驟1），然后把已知濃度的I131標記的牛胰島素添加到反應(yīng)溶液中（步驟2），樣本中的胰島素與I131標記的牛胰島素（步驟3）相互競爭與抗體的結(jié)合。使用人胰島素制備的標準曲線以及胰島素抗體結(jié)合的I131標記牛胰島素的濃度可以計算樣本中被置換的胰島素的濃度。
競爭式ELISA格式是基于初始的胰島素RIA和IgG EIA方法中的結(jié)合競爭。來自樣品的目標分析物（analyte）和參照分析物（reference analyte）與分析物特異性的抗體結(jié)合之間的競爭是這種格式的關(guān)鍵。
抗體或目標分析物都可以標記酶，并用于結(jié)合反應(yīng)。使用標記抗體（圖3Ai）時，參照分析物首先被動地吸附到微孔板的孔中，然后加入含有目標分析物的樣本，如細胞裂解液、血清等，并與固定濃度的標記抗體一起孵育。樣本中的目標分析物與固定的分析物競爭，以結(jié)合有限數(shù)量的標記抗體，隨后的酶反應(yīng)產(chǎn)生的信號與樣本中目標分析物的濃度成反比。或者，可以使用固相吸附的抗體和標記分析物（圖3Aii），樣本中的目標分析物與固定數(shù)量的標記分析物共同孵育，并與之相互競爭和固定抗體的結(jié)合。與前面的示例中一樣，生成的信號與樣本中目標分析物的濃度成反比。
直接式ELISA是最簡單的ELISA格式，樣品中的目標分析物吸附到微孔板的孔中，通過酶偶聯(lián)試劑或標記檢測抗體，直接實現(xiàn)目標分析物的檢測，如圖3B所示。
圖3. 競爭式（Ai & Aii）、直接（B）和間接（C）ELISA測試格式的原理圖。目標分析物（Analyte）代表被測定的目標蛋白質(zhì)。在競爭式ELISA中，可以標記目標分析物或抗體，而在直接或間接ELISA格式中，只標記檢測抗體。
間接ELISA類似于直接ELISA，兩者間主要差別在于主要（primary）抗體未被標記。目標分析物的檢測是通過再次添加一個酶偶聯(lián)試劑或標記檢測抗體，使其與主要抗體結(jié)合而實現(xiàn)的，如圖3C 所示。
直接ELISA更快速，因為它比間接ELISA少一個步驟。它通常用于需要快速完成的常規(guī)測試，商業(yè)化的家用懷孕測試就是這種格式的一個例子。而間接ELISA雖然較直接ELISA多一個步驟，但信號放大通常優(yōu)于直接ELISA。因此，間接ELISA通常比直接ELISA更敏感，可以測量更低豐度的蛋白質(zhì)。
正如圖3C 所示，間接ELISA較直接ELISA增加的步驟正是來自于樣本的目標分析物直接吸附到微孔板，但想要達到這樣的效果，亦有一定的難度。因為在洗板步驟中，可能會洗掉目標分析物，因此可能會增加測試的變異性。此外，非特異性地結(jié)合到微孔板的其它蛋白可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。為了克服上述挑戰(zhàn)，其它可靠性更高的格式進而衍生出來，其中有通常被稱為夾心、橋聯(lián)或競爭性ELISA（在夾心或橋聯(lián)ELISA格式中），在這些格式中，一種能與目標分析物特異性結(jié)合的生物試劑首先被吸附到微孔板中。
圖4. 夾心式ELISA（A）和橋接式（B）ELISA的原理圖
夾心式ELISA需要兩個不同的試劑或抗體，一個用于捕獲，另一個用于檢測目標分析物。這些試劑與目標分析物的不同表位（epitopes，結(jié)合位點）結(jié)合，從而形成夾心式格式（圖4A），由此產(chǎn)生的相互作用具有特別高的特異性（因為捕獲和檢測步驟都需要特異的表位識別，才能生成檢測信號）。
橋聯(lián)ELISA常用于測定具有兩個相同抗原結(jié)合位點(2價)的抗體或其它目標分析物的濃度，可以標記與捕獲相同的試劑，用于檢測一個二價的目標分析物，因此，目標分析物可被視為捕獲和檢測試劑之間的橋梁（圖 4B）。夾心或橋接ELISA 格式均可設(shè)計成為競爭式的ELISA。
上述格式是ELISA的基本設(shè)計，所有格式都可以使用競爭或抑制條件加以調(diào)整，來測定抗原或抗體（圖5），所有方法都要求與試劑預(yù)先反應(yīng)/孵育才能達到最佳狀態(tài)。這些最佳狀態(tài)可以通過添加抗原（圖5a）或抗體（圖5b）來給予挑戰(zhàn)。隨著溶液中游離的抗原（抗體）的增加，能夠與固定底物（immobilized substrate）結(jié)合的抗體（抗原）的數(shù)量則減少。洗滌步驟后，添加生色劑底物（chromophore substrate）以產(chǎn)生信號（顏色變化或發(fā)光）?？贵w/抗原挑戰(zhàn)引起的信號變化揭示了有關(guān)競爭性抗原/抗體的信息。競爭式ELISA對于測定復(fù)雜混合物中的抗原濃度相當有用，特別是在可能含有抗原的未知樣品與含有已知數(shù)量的純化抗原的類似樣品時。
免疫表位（epitope）是宿主免疫系統(tǒng)一般能夠識別的抗原分子的一部分。當抗原的表位以非共價鍵的形式與其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體的確定互補性的區(qū)域（complementarity determining region）相互作用時，就會發(fā)生特異性的識別。
抗體親和力（affinity）表示抗體與其單一目標分析物（analyte）/抗原（antigen）結(jié)合的烈度（intensity）或強度（strength），由解離常數(shù)（Kd）代表。低親和力抗體與抗原結(jié)合弱，容易解離；而高親和力抗體與抗原結(jié)合非常強，在多次的洗滌步驟中不易解離。從ELISA的角度來看，后者是首選，通常用于捕獲目標分析物。
親和度（Avidity）是衡量一個抗體與多個抗原決定因子（antigenic determinants）結(jié)合的整體強度的指標?？贵w對某一個結(jié)合位點的親和力并不總是能反映抗體-抗原相互作用的強度，例如免疫球蛋白G（IgG）有兩個抗原結(jié)合位點（2價），而IgM有10個抗原結(jié)合位點（10價），親和度表示IgG或IgM的，分別對于2個或10個抗原分子的整體結(jié)合強度（overall strength）。
關(guān)鍵試劑
一個ELISA方法最重要的組成部分是測試試劑，它決定了ELISA方法的靈敏度、特異性和方法的質(zhì)量。ELISAs常用于藥物開發(fā)：在PK評估中，定量測定蛋白生物藥的濃度；測定內(nèi)源性蛋白和生物標志物；檢測抗藥物抗體的存在以進行免疫原性評估等。LBA方法首選的關(guān)鍵試劑是單克隆抗體（MAbs）或多克隆抗體（PAbs），而不是重組靶標蛋白。為了產(chǎn)生PAbs或MAbs，需要將生物藥或生物標志物蛋白及其佐劑或載體，根據(jù)相關(guān)應(yīng)用給到合適的宿主動物物種上進行免疫。對于PAbs，兔子、山羊和綿羊是最常用的宿主物種，因為它們的體型大（產(chǎn)生的抗體量也大），容易找到血管和強健的免疫反應(yīng)。
用于免疫的每一個抗原都是高度復(fù)雜的，因為它可以呈現(xiàn)大量的，可以被不同的淋巴細胞識別的表位,這些淋巴細胞隨后被激活。激活了的淋巴細胞增殖，分化成漿細胞，并分泌出多克隆抗體的混合體。PAb庫（混合體）代表了不同抗體的集合群體，這些抗體可以識別抗原的多個表位(用于ELISA分析)。為了生產(chǎn)MAbs，需要進一步分離單個淋巴細胞，并與骨髓瘤細胞融合，以產(chǎn)生不死的雜交瘤細胞，從而持續(xù)產(chǎn)生特定的MAb。因此，同一個克?。╟lone）的抗體只識別一個抗原的單個表位。在ELISA中會頻繁使用MAbs或PAbs，其選擇（對于每種ELISA格式而言）取決于許多考慮因素：如可及性（Availability）、親和力、特異性（Specificity）和交叉反應(yīng)性（Cross-reactivity）。
抗體的特異性（specificity）是特異性地結(jié)合相關(guān)抗原的能力，與ELISA方法的選擇性（selectivity）不盡相同，但相關(guān)。選擇性是一個定量分析方法，在其它潛在干擾成分存在的情況下，從眾多其它無關(guān)的蛋白質(zhì)中鑒別和定量測定目標分析物濃度的能力。交叉反應(yīng)性（cross-reactivity）是指抗體與除目標抗原之外的其它多個抗原結(jié)合的能力。當抗原（目標分析物）的與抗體試劑結(jié)合的表位與其它蛋白質(zhì)相似時就會發(fā)生交叉反應(yīng)。一般來說，特異性和交叉反應(yīng)性對ELISA方法的選擇性和基質(zhì)效應(yīng)有很大影響。如果使用高親和力抗體作為捕獲試劑，抗體/目標分析物的復(fù)合物就能夠在含有多種蛋白質(zhì)的“混合物”樣品中有效地形成，基質(zhì)效應(yīng)會隨之降低，而方法的選擇性最終會得到提升。
表1總結(jié)了ELISA可能用到的試劑和各種通用或首選格式。
測試試劑的可及性可能因藥物開發(fā)的不同階段而異。在早期探索階段，可能無法得到MAbs或PAbs，故常常選擇重組生產(chǎn)的配體（即生物藥的靶點）作為關(guān)鍵試劑來測定游離的蛋白生物藥(therapeutic protein，TP)的濃度。在早期臨床前研究中，針對IgG Fc部分的通用抗體可用于單克隆抗體藥物，盡管僅能測定總濃度（結(jié)合靶標后的TP +游離的TPf）。
生物標志物的定量分析方法
各種體外診斷試劑盒在商業(yè)上可用于藥物的早期發(fā)現(xiàn)階段，也可從不同的供應(yīng)商獲得各種重組蛋白和抗生物標記物蛋白的抗體。雖然生物標記物的定量分析方法與PK方法相似，但這二者之間存在明顯差別。與PK方法類似，生物標志物的定量分析方法可用于測定目標基質(zhì)中生物標志物蛋白的游離濃度或總濃度。夾心式測試格式是主要選擇，通常用于測定生物標志物蛋白的游離或總濃度。雖然當一個生物藥具有抑制作用時，需要測量游離的生物標志物蛋白濃度，但開發(fā)測定游離的生物標志物蛋白的方法有相當?shù)奶魬?zhàn)性，可能需要額外的分離步驟。
人源化的或全人源的單克隆抗體或重組蛋白，作為藥物給予受試者/動物后，可誘導(dǎo)形成針對該生物藥的抗體，特別是在臨床前的動物試驗中，這些由生物藥誘導(dǎo)而形成的抗體通常被稱為抗藥物抗體（ADA）。免疫檢測方法是檢測ADA是否存在于血清中的第一級檢測。不同的ADA反應(yīng)，如表位特異性（idiotype vs. nonidiotype，特異與非特異性）和數(shù)量（滴度或相對濃度），會影響對ADA和生物藥的準確定量。由于ADAs會在血液循環(huán)中與生物藥形成免疫復(fù)合物，高濃度的蛋白生物藥能夠干擾ADA的檢測。
備注：idiotype：免疫球蛋白（如IgG）可變區(qū)域的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，賦予其抗原特異性。
LBA測試方法在各種生物分子的定量分析方面擁有各種優(yōu)勢。它們在大多數(shù)平臺（如比色計或平面電化學(xué)發(fā)光）上，成本通常很低。當高親和力MAbs用于LBAs時，LBA方法在檢測和定量分析存在于異質(zhì)性的基質(zhì)環(huán)境中的目標分析物方面，具有高度靈敏度和特異性。出于研究目的，該類方法的靈敏度可以低至每毫升毫微微克的級別（femtogram/mL）。大多數(shù)LBAs的操作程序不涉及樣品分離的步驟，而基于LC-MS/MS的定量分析方法則需要。當然，LBA也有幾個缺點，與LC-MS/MS方法相比，LBA方法的動態(tài)范圍較狹窄。雖然用于基礎(chǔ)研究的方法可以達到4-6個指數(shù)級的動態(tài)范圍，但用于規(guī)范性研究（regulated study）的驗證過的方法，其定量范圍往往僅為2-3個指數(shù)級，這是因為必須保持方法的穩(wěn)健性和更好的重現(xiàn)性。
最重要的區(qū)別是，LBA的性能取決于所使用試劑的質(zhì)量和特異性。因此，試劑生成/選擇（MAbs或PAbs）是方法開發(fā)過程中的關(guān)鍵步驟，這可能非常耗時，3到9個月不等。當使用分析物特異性的試劑來捕獲目標分析物時，這個缺點對LC-MS/MS方法也是存在的。從生物標志物方法的角度來看，試劑的交叉反應(yīng)可導(dǎo)致該方法的非特異性。因此，強烈建議進行額外的測試以闡明試劑的交叉反應(yīng)性和非特異性。
本文概述了LBA測試方法，包括其主要概念的起源和演變，并且回顧了常用的大分子生物分析方法的測試格式。最初的LBA測試方法誕生于1960年，是為測定胰島素而開發(fā)的放射免疫測試（radioimmunoassay），LBA測試方法的基礎(chǔ)是至少有一種蛋白質(zhì)與感興趣的目標分析物有相互作用。在當今的實驗室, 酶免疫測試（enzyme immunoassay）已在很大程度上取代了放射性免疫測試，成為了LBA測試方法的首選形式。
此外，本文還介紹了其它各種測試格式，如競爭式（competitive）、夾心式（sandwich）和橋接式（bridging），以及其所需的關(guān)鍵試劑。最后，簡明扼要地討論了LBA測試方法在蛋白質(zhì)生物藥開發(fā)中的應(yīng)用，以及與其它生物分析平臺的比較。
自上世紀60年代對胰島素進行定量測定以來，基于與其它生物分子結(jié)合作用的LBA方法已被廣泛地用于生物分子的定量分析。例如，在蛋白質(zhì)生物藥開發(fā)過程中，這些方法為定量分析或檢測蛋白質(zhì)提供了一種準確和經(jīng)濟有效的方法。測試試劑（MAbs或PAbs）生成/選擇是LBA方法開發(fā)過程中的關(guān)鍵步驟，一旦選擇好了試劑，不同測試平臺上的LBA方法能夠提供顯著節(jié)約時間和經(jīng)濟成本。
如前所述，另一個主要的大分子生物分析平臺是液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS/MS）。在小分子藥物的生物分析中，LC-MS/MS方法是毋庸置疑的王者，在大分子分析中，LC-MS/MS的重要性也在不斷地增加，特別是在與LBA方法以某種形式組合之后?？梢钥隙ǎ锓治鰳I(yè)界將繼續(xù)探索LC-MS/MS在蛋白質(zhì)藥物的生物分析中的應(yīng)用。生物分析行業(yè)必須證明LC-MS/MS在藥物開發(fā)的整個過程中，與LBA方法相比較，具有重現(xiàn)性（reproducibility）、可轉(zhuǎn)移性（transferability）、可靠性（reliability）和成本效益（cost–effectiveness）等方面的顯著優(yōu)勢。本系列后續(xù)將介紹相關(guān)知識，敬請關(guān)注。
本文來源：生物制藥小編
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