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袁來(lái)如此 | 大分子生物分析概論（十四_上）：LBA定量分析雙特異性生物藥的挑戰(zhàn)

作者：廣州博濟(jì)醫(yī)藥 時(shí)間：2021-08-18 來(lái)源：廣州博濟(jì)醫(yī)藥

本文為系列文章《大分子生物分析概論》的第十四篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，初步的介紹定量分析雙特異性抗體的LBA方法所面臨的挑戰(zhàn)。

由于內(nèi)容篇幅較長(zhǎng)，本文將采取上下篇形式進(jìn)行推送，敬請(qǐng)垂注！《袁來(lái)如此》專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號(hào)打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥藥物研究中心資深科學(xué)顧問(wèn)袁智博士原創(chuàng)。

與傳統(tǒng)（單特異性）的生物藥相比，雙特異性生物藥對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)（PK）的表征提出了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。在此背景下，開發(fā)生物藥的生物分析策略正在迅速演變，以支持這些不斷變化的藥物模式。

一般說(shuō)來(lái)，生物分析策略應(yīng)根據(jù)藥物的作用機(jī)制（mechanism of action，MOA）和開發(fā)階段定制。對(duì)于 mAb 藥物，用于分析藥代/毒代動(dòng)力學(xué)（PK/TK），藥效動(dòng)力學(xué)和免疫原性的分析方法通常分別為定量分析、“游離”和“總”藥物濃度、“游離”和“總”靶標(biāo)濃度、抗藥物抗體（ADAs）和中和性 ADAs的開發(fā)和驗(yàn)證。對(duì)于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的抗體衍生物（antibody derivatives），衍生物的每個(gè)功能域可能需要額外的一組檢測(cè)方法，從而可能導(dǎo)致測(cè)試方法的數(shù)量幾何級(jí)增長(zhǎng)。

此外，與開發(fā)默認(rèn)沒(méi)有生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）的mAb相比，復(fù)雜的抗體衍生物更容易發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，這意味著可能需要另一組測(cè)試方法來(lái)描述復(fù)雜抗體藥物的結(jié)構(gòu)完整性及其生物轉(zhuǎn)化后的各種產(chǎn)物（biotransformed variants）。

配體結(jié)合式測(cè)試方法（LBA）是mAbs生物分析的主力軍，同時(shí)液相色譜-質(zhì)譜方法（LC-MS）也在近年越來(lái)越受歡迎。這兩種分析技術(shù)也主要應(yīng)用于抗體藥物及其衍生物的生物分析。

由于藥物模式的復(fù)雜性，通常需要多個(gè) LBA/LC-MS 分析方法。當(dāng)每個(gè)分析方法都有特定的取樣程序，而且并非所有的檢測(cè)可以在一個(gè)生物分析實(shí)驗(yàn)室實(shí)施時(shí)，獨(dú)特的樣本采集、處理、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和分析條件，會(huì)造成復(fù)雜的后勤需求。因此，需要設(shè)計(jì)一種生物分析策略，用于表征雙特異性分子的PK特性，并研究其體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。本文提供了若干相關(guān)案例研究和監(jiān)管層面的預(yù)測(cè)。

導(dǎo)論

近年來(lái)，蛋白質(zhì)工程和生產(chǎn)方面的進(jìn)展推動(dòng)著生物制藥行業(yè)開發(fā)越來(lái)越復(fù)雜的蛋白質(zhì)藥物，其能夠結(jié)合多個(gè)藥物治療靶標(biāo)，故能夠提高療效和/或者減少劑量，用以降低毒性，使安全風(fēng)險(xiǎn)最小化，提高用藥的方便性和依從性等。雙特異性藥物被定義為基于抗體（antibody-based）或基于框架（scaffold-based）的蛋白質(zhì)藥物，其包含一個(gè)以上的工程改造功能區(qū)域，該功能區(qū)域結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的抗原靶點(diǎn)。本文集中關(guān)注雙特異性藥物的兩個(gè)獨(dú)特的功能域，其結(jié)合與疾病的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì)，而不考慮抗體骨（主）干（antibody backbone）的功能。

開發(fā)雙特異性生物藥的領(lǐng)域，基于并發(fā)展了傳統(tǒng)的單分子靶點(diǎn)的抗體免疫療法的框架，正在蓬勃發(fā)展，以靶向協(xié)同的分子途徑（target synergistic molecular pathways）來(lái)更有效地治療疾病。兩種雙特異性抗體，blinatumomab（Blincyto）和catumaxomab（Removab）已經(jīng)在美國(guó)或歐盟批準(zhǔn)上市，用于腫瘤適應(yīng)癥的治療；這證明了這類藥物分子的應(yīng)用價(jià)值。目前有60多種用于癌癥和其它疾病的新型雙特異性生物藥正在臨床開發(fā)之中。

雙特異性生物藥分子

雙特異性分子可以以各種不同的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，利用抗體可用的各種結(jié)合域。這些結(jié)合域包括可變重鏈(VH)、可變輕鏈(VL)、單鏈分子(ScFv)和/或抗體的Fc域，可以組合使用這些結(jié)構(gòu)域，以結(jié)合多個(gè)分子靶標(biāo)。具有多個(gè)Fab結(jié)合域的雙可變域免疫球蛋白(dual-variable domain immunoglobulin，DVD -Ig)這樣的大型免疫球蛋白分子和較小的串聯(lián)ScFv結(jié)構(gòu)域(diabody)，在分子大小和結(jié)構(gòu)上代表了兩個(gè)極端，它們都可通過(guò)各種蛋白質(zhì)工程技術(shù)生產(chǎn)出來(lái)(圖1)。

圖1. 雙特異性分子的構(gòu)造。本圖展示了三個(gè)雙特異性抗體的例子：1. Hetero-lg；2.雙可變結(jié)構(gòu)域/dual variable domain；3.antibody-peptibody；這些代表了不同的分子大小，結(jié)構(gòu)及復(fù)雜性。

目前的技術(shù)允許蛋白質(zhì)結(jié)合域（protein binding domains）和抗體支架（antibody scaffolding）的多種組合，形成一系列獨(dú)特的藥物模式（drug modalities）。雙特異性藥物的幾個(gè)功能類別包括：與可溶性靶標(biāo)結(jié)合以抑制或刺激相關(guān)功能、與細(xì)胞靶標(biāo)結(jié)合以拮抗或刺激相關(guān)功能、與細(xì)胞靶標(biāo)結(jié)合以招募免疫細(xì)胞以促進(jìn)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)功能。

對(duì)雙特異性分子獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制(MOA)給藥代動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)(PK/PD)評(píng)估，體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的確定以及臨床前和臨床藥物開發(fā)階段所需的生物分析支持帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。

雙特異性抗體

雙特異性抗體是通過(guò)基因工程重組生產(chǎn)的抗體，由兩個(gè)不同的結(jié)合域（two distinct binding domains）組成，能夠結(jié)合兩種不同的抗原或同一抗原的兩個(gè)不同表位。它們可以分為兩個(gè)主要類別，即帶有或缺少Fc區(qū)域的兩類。關(guān)于生物分析支持， FDA關(guān)于雙特異性抗體開發(fā)的指南指出：可能需要開發(fā)多種PK定量方法，以定量總（total），結(jié)合（bound）和未結(jié)合（unbound）的雙特異性抗體的濃度；也可能需要多個(gè)免疫原性測(cè)試方法，來(lái)測(cè)試對(duì)雙特異性抗體不同結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)。

由于雙特異的性質(zhì)，雙特異性抗體的未結(jié)合或“游離”PK定量方法可以包括三個(gè)測(cè)定方法：一個(gè)雙功能方法同時(shí)測(cè)定兩個(gè)活性結(jié)合域（active binding domains）和兩個(gè)單功能方法分別測(cè)定二個(gè)結(jié)合域中之一。雙功能方法分別使用兩個(gè)靶標(biāo)蛋白作為捕獲和檢測(cè)試劑。單功能方法使用一個(gè)靶標(biāo)蛋白作為捕獲試劑，而使用抗人類IgG作為檢測(cè)試劑。通常，在解釋檢測(cè)結(jié)果時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，因?yàn)閱翁禺愋苑椒ㄈ狈μ禺愋?，故也能檢測(cè)到雙功能分子。

雙特異性抗體的定量PK分析方法面臨生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）的重大挑戰(zhàn)，因此，通常定制開發(fā)方法以定量某個(gè)功能域生物轉(zhuǎn)化的程度。獨(dú)特的雙特異性構(gòu)造可能造成意外的生物轉(zhuǎn)化路徑，并可能使PK行為復(fù)雜化。

雙特異性生物藥的PK/PD

雙特異性分子增加了PK建模的復(fù)雜性，例如，表征靶向介導(dǎo)的藥物處置需要考慮兩個(gè)靶點(diǎn)的表達(dá)，它們以不同的頻率出現(xiàn)在不同的細(xì)胞類型上。“游離”藥物濃度與“總”藥物濃度的定量，對(duì)于PK/PD建模至關(guān)重要，特別是當(dāng)涉及可溶性靶點(diǎn)時(shí)；但是，由于靶標(biāo)蛋白在體內(nèi)的不同表達(dá)模式（expression patterns），藥物定量分析可能會(huì)變得更加復(fù)雜。在絕大多數(shù)的臨床研究中，藥物濃度是在所謂的“中央隔室central compartment”或系統(tǒng)循環(huán)（systemic circulation）中，以血漿或血清樣本的形式，測(cè)定的，這在很大程度上是由于易于從服用藥物的受試者中取樣。根據(jù)幾十年累積的科學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)藥物濃度（systemic drug concentrations）反映了藥物在靶標(biāo)作用部位的濃度。血液病是一個(gè)例外，但即使是血液病也通常含有固體組織的部分。系統(tǒng)藥物濃度和作用地點(diǎn)（site-of-action）的藥物濃度之間的關(guān)系會(huì)因作用地點(diǎn)的不同而不同，但適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型數(shù)據(jù)通常為人體狀況提供了可靠的模型。

由于藥理學(xué)或藥效學(xué)響應(yīng)依賴于全身藥物濃度，正確理解PK-PD關(guān)系對(duì)于預(yù)測(cè)達(dá)到預(yù)期響應(yīng)的劑量和暴露量極為有用。同樣重要的是，確定可能發(fā)生在每個(gè)獨(dú)特的雙特異性分子上的任何潛在的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化（in vivo biotransformation），并徹底表征不同的藥物在暴露量和活性方面的差異?？傮w來(lái)說(shuō)，這些表征有助于理解藥物的暴露量-響應(yīng)關(guān)系，并提供了，基于藥物變構(gòu)體活性，優(yōu)化劑量設(shè)計(jì)方案。

PK評(píng)估是非臨床毒理學(xué)研究和臨床開發(fā)的必然需求，在非臨床疾病模型評(píng)估中也發(fā)揮著重要作用；一般在非臨床疾病模型評(píng)估中，研究藥物劑量-響應(yīng)的特性，用以選擇先導(dǎo)藥物。非臨床毒理學(xué)研究中的全身暴露量數(shù)據(jù)，可用于確定首次對(duì)人(FIH)研究的安全起始劑量，該起始劑量是基于此類安全研究確定的暴露量余量（exposure margin）。暴露量余量由未觀察到不良反應(yīng)水平(NOAEL)的動(dòng)物暴露量與選定人體劑量的預(yù)期暴露量的比值確定，通常設(shè)定為比NOAEL預(yù)期的人體等效劑量(HED)低10倍。由于雙特異性分子可靶向多種生理或病理途徑，因而可能具有更強(qiáng)的藥理和/或毒理學(xué)作用；故監(jiān)管機(jī)構(gòu)可能要求制藥商使用“最低預(yù)期生物效應(yīng)水平”（MABEL）模型來(lái)選擇FIH劑量,這意味著需要比基于NOAEL更低的起始劑量。臨床研究中較低的起始劑量，意味著可能需要提高PK方法的靈敏度；考慮到雙特異性分子的復(fù)雜性，這可能是一個(gè)挑戰(zhàn)。

PK定量分析方法

為了支持符合藥物預(yù)期用途的PK數(shù)據(jù)的可靠性和有效性，監(jiān)管機(jī)構(gòu)希望制藥商，對(duì)所有的GLP研究/關(guān)鍵臨床試驗(yàn)，使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的分析方法來(lái)定量藥物濃度。監(jiān)管部門為生物分析方法的驗(yàn)證提供了具體的指南，這些指南在全球各監(jiān)管機(jī)構(gòu)中普遍一致。這些指南文件清楚地闡明了對(duì)分析方法參數(shù)的性能及其可接受值的監(jiān)管期望，包括收集，儲(chǔ)存和分析過(guò)程中研究樣本的完整性。關(guān)于檢測(cè)試劑的討論，特別是捕獲和檢測(cè)試劑的選擇，分析格式和技術(shù)平臺(tái)，以及用于PK表征和PK/PD相關(guān)性分析的相關(guān)待測(cè)物，都可以在科學(xué)文獻(xiàn)中找到。對(duì)于靶標(biāo)在血液循環(huán)中的藥物（這些靶標(biāo)可在血清或血漿樣本中形成藥物-靶標(biāo)復(fù)合物），關(guān)于應(yīng)當(dāng)測(cè)定的最相關(guān)的藥物形式(不包括生物轉(zhuǎn)化物/ biotransformants)仍然存在爭(zhēng)議:“總體”(結(jié)合了 + 未結(jié)合靶標(biāo)的藥物)或“游離部分”或“活性部分”(未結(jié)合靶標(biāo)的部分)。關(guān)于總藥物濃度和游離藥物濃度的問(wèn)題最好根據(jù)靶標(biāo)的已知狀況，藥物的MOA和特征，項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)的意見(jiàn)，技術(shù)可行性，以及監(jiān)管反饋（如果需要的話），按個(gè)案處理的原則解決。最近有文獻(xiàn)討論了相關(guān)問(wèn)題。

LBA定量方法

生物分析策略的選擇可以根據(jù)藥物特定的開發(fā)階段而有所不同。例如,在非臨床物種中研究人類蛋白藥物, 使用不與非人類物種交叉反應(yīng)的，針對(duì)人類蛋白的試劑，特別是非人靈長(zhǎng)類同源物，例如,重組人源化單克隆抗體（recombinant humanized monoclonal antibody，rhuMabs）,可以開發(fā)一種通用的，快速且經(jīng)濟(jì)的PK分析方法來(lái)測(cè)定總藥物濃度，以支持全面的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。然而,這種方法不能用在臨床研究中,更加藥物特異性試劑，例如，靶標(biāo)抗體和anti-idiotypic抗體，更可能是必要的：使用通用試劑與內(nèi)源性分子發(fā)生交叉反應(yīng)會(huì)干擾蛋白藥物濃度的定量，而測(cè)定游離藥物的濃度與建立PK-PD關(guān)系息息相關(guān)。非臨床和臨床生物分析策略的另一個(gè)問(wèn)題是，使用針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)（target binding site）的試劑，例如針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)結(jié)合域的靶標(biāo)和/或anti-idiotypic抗體的組合，來(lái)測(cè)定完整的雙特異性分子是否最有價(jià)值。

Anti-idiotypic 抗體

當(dāng)一種抗體與另一種抗體的idiotope結(jié)合時(shí)，它被稱為抗idiotope抗體。抗體的可變部分，包括獨(dú)特的抗原結(jié)合位點(diǎn)，被稱為idiotope。Idiotopes內(nèi)的表位組合對(duì)于每種抗體都是獨(dú)一無(wú)二的(圖2).由于目前開發(fā)的大多數(shù)單克隆抗體藥物是人源的或人源化的，因此最可能誘導(dǎo)抗藥物抗體（ADA）的免疫原性表位（immunogenic epitopes），存在于提供大多數(shù)結(jié)合接觸面（binding contacts）的hypervariable complementarity determining regions（CDR）之內(nèi)。可以生成抗idiotypic抗體，特異性地結(jié)合一個(gè)單克隆抗體藥物。這些高度特異性的抗體可用于，以不同測(cè)試格式，開發(fā)藥代動(dòng)力學(xué)（PK）定量方法，以測(cè)定臨床前和臨床樣本中的游離藥或總藥物的濃度，或在ADA測(cè)試中作為陽(yáng)性對(duì)照等。

圖2. 抗體idiotope：抗體可變區(qū)域的，獨(dú)特的抗原決定因素（antigenic determinants）的集合。

在這方面，藥物的MOA在選擇合適的分析方法時(shí)很重要，特別是在藥物活性依賴于雙特異性藥物對(duì)兩個(gè)靶點(diǎn)的同時(shí)作用的情況下?？笴D3/抗腫瘤靶標(biāo)雙特異性藥物就是一個(gè)例子：測(cè)定完整的，有活性的雙特異性分子是充分表征該藥物的最佳策略。反之，如果藥物活性依賴于一個(gè)靶點(diǎn)的參與，而另一個(gè)靶點(diǎn)的參與只是增強(qiáng)了藥物活性, 那么，測(cè)定完整藥物可能就不那么重要了；此時(shí)，只使用一種藥物特異性試劑 (例如，單臂靶向/1-arm target，單臂/1-arm延長(zhǎng) PK或增加暴露量) 可能是合理的策略。另一種方法的一個(gè)例子是評(píng)估catumaxomab抗體的PK: 該P(yáng)K分析方法利用了該抗體藥物是小鼠/大鼠的嵌合結(jié)構(gòu)體，使用了特異性的antispecies immunoglobulin的捕獲/檢測(cè)試劑。這里，使用了一個(gè)針對(duì)藥物的嵌合結(jié)構(gòu)的混合通用分析格式（mixed generic assay format）；該方法特異性來(lái)自嵌合結(jié)構(gòu)，而不涉及CDRs。這種方法基于兩個(gè)假設(shè): 首先，單克隆抗體(mAb)藥物在體內(nèi)通常非常穩(wěn)定。其次，靶標(biāo)蛋白沒(méi)有可檢測(cè)到的可溶性形式。因此，該P(yáng)K分析方法可以測(cè)定血液循環(huán)中游離的catumaxomab單抗，這是符合其預(yù)期用途的。一般來(lái)說(shuō)，默認(rèn)的生物分析策略是利用雙特異性藥物的雙特異性，但需要認(rèn)識(shí)到開發(fā)這樣的試劑是耗時(shí)的和有挑戰(zhàn)的；并且可能在藥物發(fā)現(xiàn)甚至非臨床研究階段還沒(méi)有這樣的試劑。下面將更詳細(xì)地考量各種選擇。

PK定量方法的設(shè)計(jì)

完整雙特異性分子的分析方法

完整雙特異性分子定量的目的是測(cè)定生物基質(zhì)中完整的雙特異性分子。該測(cè)試只測(cè)定有活性雙特異性分子，其沒(méi)有任何功能區(qū)域被抗藥物抗體(ADA)或血液循環(huán)中的靶點(diǎn)切斷（clipped off）或阻斷（blocked）。完整分子的檢測(cè)方法通常需要使用靶標(biāo)抗體和/或anti-idiotypic抗體，以測(cè)定包含可結(jié)合捕獲和檢測(cè)試劑這兩個(gè)功能域的分子。在評(píng)估體內(nèi)或體外穩(wěn)定性時(shí)(假設(shè)試劑可用)，建議采用完整分子的分析方法。完整分子定量的測(cè)試格式如圖3A所示。

這種測(cè)試格式使用兩個(gè)靶標(biāo)分子或兩個(gè)完全中和性的anti-idiotypic抗體，或兩者的組合。最近， LC-MS，結(jié)合affinity pull-down（使用靶標(biāo)或anti-idiotypic抗體）以分離待測(cè)物，已用于表征的生物基質(zhì)中的藥物完整分子。Affinity pull-down是一種類似于免疫沉淀（immunoprecipitation）的小規(guī)模親和純化技術(shù)，只是抗體也可以被其它親和系統(tǒng)所取代。

這是一種sequential方法：首先，使用anti-idotypic抗體來(lái)下拉（pull down）雙特異性藥物的游離形式；然后，用LC-MS法進(jìn)行定量。利用這種形式，可以確定雙特異性分子的游離濃度。然而，在方法開發(fā)過(guò)程中需要考慮幾個(gè)關(guān)鍵因素:

該測(cè)試格式必須設(shè)計(jì)好，以避免潛在的空間位阻效應(yīng)（steric hindrance）。一些雙特異性分子被設(shè)計(jì)為靶向一個(gè)可溶性分子和一個(gè)與細(xì)胞結(jié)合的分子(細(xì)胞表面受體)。這種雙特異性分子被明確設(shè)計(jì)為與兩個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)相互作用，以發(fā)揮其預(yù)期的藥理活性。然而，雙特異性分子和檢測(cè)試劑在檢測(cè)環(huán)境中可能有不同的相互作用，換句話說(shuō)，在塑料容器表面可能表現(xiàn)出不同的相互作用。因此，應(yīng)該理解和謹(jǐn)慎的處理空間位阻效應(yīng)。例如，從位阻效應(yīng)研究中收集的數(shù)據(jù)，例如，在Octet平臺(tái)上考查域結(jié)合干擾（domain binding interferences）的數(shù)據(jù)，可能指向選擇一個(gè)特定的捕獲和檢測(cè)順序，以避免不必要的空間位阻效應(yīng);

一些雙特異性分子，通過(guò)協(xié)同作用，具有很高的藥效學(xué)效力（highly pharmacologically potent），這可能意味著只需要非常低的臨床劑量。因此, 基于已知的劑量-響應(yīng)數(shù)據(jù)和劑量模型（dose modelling）的分析方法靈敏度將會(huì)是一個(gè)重要的考量指標(biāo);

與傳統(tǒng)的單特異性抗體相比，雙特異性分子更有可能出現(xiàn)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化（biotransformation），即體內(nèi)不穩(wěn)定性（in vivo instability）。生物轉(zhuǎn)化不僅可能影響雙特異性分子的活性，而且還可能影響定量雙特異性分子的可靠性。因此，完全中和性，anti-idiotypic抗體或靶標(biāo)分子(圖3A)有可能允許檢測(cè)潛在的生物轉(zhuǎn)化（consequential biotransformation）;

圖3. 用于定量雙特異性分子的不同測(cè)試格式和試劑。(A)完整分子的測(cè)定方法：使用靶標(biāo)蛋白X和靶標(biāo)蛋白Y作為檢測(cè)試劑，測(cè)定完整雙特異性分子的濃度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗體和靶標(biāo)Y蛋白作為檢測(cè)試劑來(lái)測(cè)量功能域Y的濃度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗體和X靶標(biāo)蛋白作為檢測(cè)試劑來(lái)測(cè)量功能域X的濃度。(D)總濃度測(cè)定方法：通過(guò)使用兩種抗Fc抗體作為測(cè)試試劑來(lái)測(cè)定雙特異性分子的所有可溶形式。

與單特異性生物藥分子類似，如常規(guī)的單克隆抗體，ADA可以通過(guò)阻斷捕獲或檢測(cè)試劑與藥物的結(jié)合來(lái)干擾對(duì)雙特異性分子的定量(注意不要與改變的藥物清除率相混淆)。此外，一個(gè)結(jié)構(gòu)域可能是immunodominant；那么取決于測(cè)試格式，這可能會(huì)導(dǎo)致PK分析結(jié)果的差異。另外，也許除了內(nèi)源性的IgG4分子之外，雙特異性分子所固有的新穎，非天然結(jié)構(gòu)，可能使雙特異性分子比單特異性分子更容易誘發(fā)ADA反應(yīng)，這是免疫原性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一個(gè)考慮因素。

功能域分析（functional domain assay）

功能域分析是測(cè)定一個(gè)功能域的濃度，此格式可用于展示相關(guān)的單一功能域的濃度。當(dāng)雙特異性的MOA使得藥物分子的一部分（a partial molecule）保留部分活性時(shí)(如可溶性靶標(biāo)，融合蛋白，或肽激動(dòng)劑)，這些檢測(cè)顯得尤為重要。功能域分析的目的是確定哪個(gè)功能域是有活性的，因此，可用于解釋與ADA的形成或生物轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能喪失。

單域測(cè)試格式的設(shè)計(jì)如圖3B和3C所示。該方法特意使用藥物靶標(biāo)，或抑制性anti-idiotypic抗體來(lái)分析雙特異性分子的游離結(jié)構(gòu)域（free domain），并與抗Fc或抗框架（anti-framework）抗體，作為捕獲或檢測(cè)試劑，聯(lián)用。這些分析方法可用于藥物開發(fā)的任何階段。有時(shí)，基于細(xì)胞的測(cè)試方法可以用于測(cè)量單個(gè)功能域，如blinatumomab情況。

圖3. 用于定量雙特異性分子的不同測(cè)試格式和試劑。(A)完整分子的測(cè)定方法：使用靶標(biāo)蛋白X和靶標(biāo)蛋白Y作為檢測(cè)試劑，測(cè)定完整雙特異性分子的濃度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗體和靶標(biāo)Y蛋白作為檢測(cè)試劑來(lái)測(cè)量功能域Y的濃度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗體和X靶標(biāo)蛋白作為檢測(cè)試劑來(lái)測(cè)量功能域X的濃度。(D)總濃度測(cè)定方法：通過(guò)使用兩種抗Fc抗體作為測(cè)試試劑來(lái)測(cè)定雙特異性分子的所有可溶形式。

總濃度分析方法（total assay）

總體測(cè)定法（total assay）用于測(cè)定雙特異性分子的所有可溶形式。這種測(cè)試格式可用于顯示雙特異性分子的存在，而不考慮任何結(jié)構(gòu)或功能的變化。該分析方法通常用于測(cè)定蛋白質(zhì)的主（骨）干（backbone）結(jié)構(gòu)，如Fc結(jié)構(gòu)域。但這可能并不適用于所有的構(gòu)造；取決于構(gòu)造的性質(zhì)，也不一定適用于所有的分子變構(gòu)體，例如，在臨床研究中rhuMab雙特異性藥物?？傮w測(cè)定法應(yīng)當(dāng)耐受ADA和與靶標(biāo)的結(jié)合（target binding）。圖3D描述了總體測(cè)定法，其中兩個(gè)與不同表位結(jié)合的抗人Fc抗體可以用作捕獲和檢測(cè)試劑。

圖3. 用于定量雙特異性分子的不同測(cè)試格式和試劑。(A)完整分子的測(cè)定方法：使用靶標(biāo)蛋白X和靶標(biāo)蛋白Y作為檢測(cè)試劑，測(cè)定完整雙特異性分子的濃度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗體和靶標(biāo)Y蛋白作為檢測(cè)試劑來(lái)測(cè)量功能域Y的濃度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗體和X靶標(biāo)蛋白作為檢測(cè)試劑來(lái)測(cè)量功能域X的濃度。(D)總濃度測(cè)定方法：通過(guò)使用兩種抗Fc抗體作為測(cè)試試劑來(lái)測(cè)定雙特異性分子的所有可溶形式。

同樣，單一多克隆抗人IgG試劑也可用作捕獲和檢測(cè)試劑。但此方法只用于非臨床研究。對(duì)于測(cè)量總體藥物濃度， LC-MS非常有用，特別是當(dāng)沒(méi)有特定的試劑可用時(shí)。總體測(cè)定法可與“完整intact”或“有效active”藥物測(cè)定法，結(jié)合使用，或同時(shí)使用兩者，以評(píng)估體內(nèi)外（in vivo /ex vivo）的穩(wěn)定性，以及生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）對(duì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的影響，例如，某些deamidation或氧化反應(yīng)可能破壞藥物與靶標(biāo)的結(jié)合。

PK樣本中生物環(huán)境的復(fù)雜性為使用哪一種定量方法增加了另一層挑戰(zhàn)。生物分析方法的應(yīng)用是從藥物發(fā)現(xiàn)和臨床前安全性評(píng)估期間的動(dòng)物研究開始的，持續(xù)到臨床開發(fā)，并延伸到上市后的生命周期管理(即附加適應(yīng)癥和/或組合療法)。正如前面所指出的，不同的分析策略可以在不同的開發(fā)階段使用；當(dāng)體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系確立之后，可以在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的整個(gè)過(guò)程中開發(fā)和使用單一的定量分析方法。但是，需要對(duì)分析方法的生命周期管理有特殊考慮，以便將來(lái)自多個(gè)物種和不同目標(biāo)患者群體的PK/PD知識(shí)整合到所探索適應(yīng)癥中去。

雙特異性分子的方法驗(yàn)證和認(rèn)證（method validation & qualification）

對(duì)雙特異性分子的方法驗(yàn)證和認(rèn)證與其他大分子一樣，包括精密度和準(zhǔn)確度，稀釋線性度，選擇性，干擾和特異性，以及穩(wěn)定性測(cè)試，以確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性和完整性。然而，由于雙特異性分子的性質(zhì)，如上所述，在開發(fā)完整分子的分析方法時(shí)，對(duì)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的特異性和分析干擾的評(píng)估都是必要的。

特別聲明

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