限于篇幅，本文只探討3個議題，對其它相關問題感興趣的讀者請閱文末的參考文獻。
將ELISA方法轉(zhuǎn)移到其它分析平臺
在開發(fā)臨床前LBA分析方法時，ELISA可能是首選的方法，因其簡單性，低成本，并且不需要專門的儀器設備。但是，如果ELISA方法不能滿足靈敏度和穩(wěn)健性要求時，特別是對GLP毒理/毒代研究而言，需要在一個CRO實施該研究時，往往需要將一個ELISA方法轉(zhuǎn)移到MSD或者GYROS平臺至上實施。
MSD
從ELISA轉(zhuǎn)移到MSD平臺相對簡單；當使用特定抗體對的ELISA方法無法到達所需要的靈敏度時，會經(jīng)常實施這樣的轉(zhuǎn)移來減少基質(zhì)效應，提高靈敏度或增加定量動態(tài)范圍。然而，就像其它方法轉(zhuǎn)移一樣，試劑的差異和不同的修飾（modifications），如ruthenium或生物素標記，可能會影響方法的效能。因此，雖然可以在MSD上重新使用已有的抗體對和測試格式，但將需要調(diào)整校準品（Cs）和QCs的濃度，并充分驗證新的方法。
Gyrolab
在理想的情況下，需要小體積樣本或半自動化的分析方法應當直接在Gyrolab平臺上開發(fā)。如果一對抗體（antibody pair）可用于相同的捕獲-檢測組合，則將ELISA方法直接成功地轉(zhuǎn)移到Gyrolab上的可能性更大； 盡管可能需要重新優(yōu)化，以提高靈敏度和/或擴展動態(tài)范圍。 重新優(yōu)化包括測試抗體對的組合；調(diào)整抗體濃度，以最大化靈敏度和動態(tài)范圍；測試選擇性，以盡量減少MRD；以及重建動態(tài)范圍和QC水平。在轉(zhuǎn)移方法到Gyrolab平臺的時候，修改試劑，如使用生物素（biotin）或熒光標記，也會影響測定性能。在任何情況下，都需要在此平臺實施完全的方法驗證。
BIAcore
BIAcore和ELISA之間的差異太大，不能直接轉(zhuǎn)移分析方法；因此，需要進行方法的再開發(fā)，和全面的方法驗證。 由于BIAcore是一個基于流體的系統(tǒng)，因此不宜直接與基于固相（例如，微孔板）的免疫測試方法進行比較。需要進一步開發(fā)BIAcore方法，例如芯片的固定（immobilization）和再生條件，用于固定和再生緩沖液的試劑，試劑的穩(wěn)定性，確定標準品和質(zhì)量控制樣品，以及配體結合測試（LBA）方法的其他方面。
Luminex
如果以Luminex格式定量單個待測物，則從ELISA格式的方法轉(zhuǎn)移在測試方法的布局方面非常簡單，盡管需要制備，評估和驗證新的試劑（例如，dye-coated beads，熒光標記的檢測抗體）。有時，在洗滌步驟中需要額外的微孔板（真空或磁珠板）。如果需要將多個ELISA方法組合并轉(zhuǎn)移到一個Luminex方法（由于其multiplexing功能），則需要進行額外的研究；并且，優(yōu)化方法參數(shù)可能需要更多的方法開發(fā)時間。總體而言，必須全面驗證單通路和multiplex格式的Luminex方法；ELISA方法中使用的條件有助于確定開發(fā)Luminex方法的格式和抗體對。
分析大數(shù)量樣本和儀器故障
MSD
對于在MSD上的樣本分析，校準品（Cs）和QCs的位置通常與ELISA的位置相同。另一方面，值得注意的是：對微孔板一次只讀取四個孔的數(shù)據(jù)，而且在施加電壓后只能讀取一次。因此，如果發(fā)生儀器故障，可能無法測定整個校準曲線；或者取決于微孔板設置（plate set-up），可能缺少一組QC的一部分，這通常發(fā)生在水平設置（horizontal set-up）中。對于垂直設置（vertical set-up），更有可能獲得校準品和第1組QC，而不是第二組QC。在這兩種情況下，將需要重新讀取整個微孔板。如果儀器發(fā)生故障，而且讀數(shù)緩沖液已添加到微孔板中，則可能需要重新分析（re-assay）樣品，因為檢測信號會隨時間顯著地減少。
Gyrolab
通常，一個分析運行被定義為一個CD，在每個CD上都放置有校準品和 QCs。如果放置在不同CDs上的QCs的精密度和偏差符合接受標準，則在無人值守的運行中處理的最多五張CDs的系列可以定義為一個單次運行。 這需要測試和評估一個給定的格式是否滿足上述接受標準，因為這取決于能否快速捕獲待測物的和試劑的穩(wěn)定性。
需要將接受標準應用于每個CD，這意味著具有失敗的QCs和/或失敗校準曲線的CDs會被拒絕，而來自同一個多個CD運行中的其它CDs可以通過。如果含多個CD的運行僅有一條標準曲線，并且此曲線不符合接受條件，則此多個CD的運行的所有數(shù)據(jù)將被拒絕。由于多個CD運行的風險，故應在方法驗證時，需要對樣品分析時的校準曲線和QCs設置進行評估。在任何情況下，每個CD都必須含有QCs。
如果在運行過程中懷疑針頭故障，例如，觀察到結構之間（inter-structure）高的CVs，則需要使用供應商提供的儀器日常維護測試方法，測試液體處理裝置的性能。故可以識別不符合接受標準的樣本，校準品或QCs所使用的針頭，并可以在未來的運行中重新分析。液體處理裝置有10個針頭，分析數(shù)據(jù)指明了用于轉(zhuǎn)移某一樣本的針頭。
一些較新的LBA分析平臺，包括Gyrolab，提供比ELISA更寬泛的動態(tài)范圍。盡管如此，仍建議使用相同數(shù)量的校準品和 QCs（在每個CD/微孔板的每個QC級別重復兩次）進行驗證（LLOQ，LQC，MQC，HQC，ULOQ）和樣品分析（LQC，MQC，HQC），如同對ELISA方法建議的那樣。
Luminex
常見的做法是設置板中（in-plate）校準品，并重復（duplicate）分析校準品和樣本。校準品的范圍通常比 ELISA的范圍更寬，以適應各種待測物濃度，并確定每個待測物的校準曲線和QCs響應。值得指出，對于另一種待測物，校準曲線上的錨定點可能不一樣。
如果儀器在運行中失敗（即，產(chǎn)生一個部分運行partial run），只要相關校準品和QCs成功完成且可以接受，則仍然可以使用已分析樣本的數(shù)據(jù)。與某些順序測定平臺（sequential platforms）相比，這不太令人擔心；而在那些順序平臺上，只有有限的QCs位于相對較大量的樣本之間；這樣的話，就可能沒有足夠的QCs來判斷許多樣本分析的結果是否有效。
BIAcore
該平臺與RIA一樣，系列式地（in series）分析樣品，并使用微孔板加載樣本。因此，有兩種方法可以運行 BIAcore 樣本分析。與 ELISA一樣，按96孔，設置校準品和QCs；或者將兩個板（或更多）可以作為一個整體來運行：在開始時，分析校準品，并且在整個樣本分析中穿插幾組QCs。產(chǎn)生部分運行結果的原因，可能是由于儀器故障；也可能是由于未知原因?qū)е翾C失敗。應根據(jù)發(fā)生的情況和時間處理儀器故障。在由于未知原因?qū)е翾C失敗的情況下，當兩組已接受的QCs之間的所有樣本都需要重新分析時，可以使用bracket approach，如表3所示。
表3. Biacore樣本分析設置
總體而言，如果40%或更多個QC失敗，則必須重新分析，在可接受的最后一組QC之后的，所有樣本。只有在運行開始時的一組QC都通過了的情況下，才能接受第一組樣本的分析結果。如果QC的成功和失敗是零星的（sporadic），則整個樣本分析運行失敗，必須進行原因調(diào)查。RIA使用類似的方法，系列式地分析一組試管。
實施樣本分析的最佳實踐
1.在方法開發(fā)的過程中，最好消除殘留（carry-over），而不是在樣本分析中加以計算校正。
2.對于每個平臺，應使用短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)來確定每次運行的持續(xù)時間，以確保樣本穩(wěn)定性。
3.一個分析運行不限于96個數(shù)據(jù)點（校準品加樣本）；例如，對于基于不同硬件支持，如CD和/或系列運行[run in series]，如RIA，BIAcore，Erenna®，和 Gyrolab的平臺。
4.在分析運行開始時，首先分析標（校）準曲線；之后，以合理的頻率在運行中間隔地分析QCs，以驗證該分析平臺上的結果。取決于如何定義一個分析運行，可以在每個固體支持（solid support）上設置校準品，也可以設置在一個微孔板/CD上；之后是QCs間隔的一系列樣本。無論一個分析運行是如何定義的，應當有規(guī)律地多次分析QCs，以確認運行內(nèi)的精密度。
5.只要在方法驗證期間確定的%CV在可接受的范圍內(nèi)，例如，小于或等于目前能夠接受的15%（對小分子而言），則可以進行單個樣品分析，并采用最嚴格的接受標準。如果運行超過多個固體支持，則%CV標準指的是重復（duplicate）運行的QCs，和包括多個固體支持的運行內(nèi)精密度。
6.對于方法轉(zhuǎn)移，在更改分析方法的平臺或格式時，大多數(shù)平臺需要重新驗證；即便是部分驗證也可能錯過對一些關鍵參數(shù)的評估。因此，建議對樣本分析方法進行完整的重新驗證。
7.Multiplexing：建議盡可能在待測物的混合物中，驗證每一個待測物。在樣本分析期間，如果一個待測物的分析失敗，則應重新分析所有樣本，并屏蔽先前合格待測物的分析結果。
總結與前瞻
總之，大多數(shù)藥物發(fā)現(xiàn)階段的PK/PD免疫分析可以在MSD或Gyrolab平臺上進行。Gyrolab還具有運行時間短，樣本體積小和自動化，等附加優(yōu)勢，因此對臨床前生物分析極具吸引力。無論分析平臺如何，本文強烈建議，在最終所需分析方法的同一平臺上，篩選試劑和評估方法的性能。在另一方面，超高靈敏度和multiplexing平臺是特殊的應用平臺，通常不能對試劑進行高通量篩選。因此，可以首先在ELISA，MSD，Gyrolab或BIAcore（SPR技術）平臺上對試劑進行篩選，然后在相關特殊平臺上優(yōu)化并最終建立相關方法。Simoa™平臺因其超高靈敏度（可以使用微量樣本體積）和自動化操作，在相當?shù)某潭壬峡梢蕴娲鶪yrolab平臺，用于臨床前PK樣本分析。
針對可溶性靶標的新藥項目，需要在方法開發(fā)的開始，就利用BIAcore平臺使用的SPR技術來克服耐受性（tolerance）問題。選擇分析平臺時，應當牢記最終目標。雖然獲得完美的方法參數(shù)是最理想的，但就檢測方法的局限性和項目需求而言，需要切合實際；因此，需要有愿意在使用的樣本體積或分析運行的時間，等參數(shù)上，做出妥協(xié)，以滿足整體需求。與項目團隊良好的溝通有助于確定相關工作的優(yōu)先級別，滿足對分析方法的需求并滿足相關時間表。當項目的目標預期發(fā)生變化時，需要對分析方法的格式保持足夠的靈活性，以便在不同的分析平臺之間，輕松地轉(zhuǎn)移分析方法。
每個平臺在檢測試劑，如Sulfo-tag、horseradish peroxidase（HRP或其他酶）方面，差異最大。因此，試劑的生物素化（biotinylation），當與各自對應的鏈球菌蛋白標記的試劑（streptavidin-tagged reagents）一起使用時，可以實現(xiàn)分析方法在這些平臺之間的無縫轉(zhuǎn)移。在需要將捕獲試劑生物素化的平臺（Gyrolab）上，這些生物素化的試劑可以作為捕獲（capture）使用。無論是分析針對可溶性靶標的藥物的游離的，還是結合的百分比，或是分析復雜分子的分子完整性，都應當利用免疫測試方法的多功能性（versatility），并相應地考慮合適的分析平臺。雖然免疫分析領域正在迅速發(fā)展，但LC-MS等正交性生物分析平臺也在平行地發(fā)展，有時可以作為免疫分析方法的補充。因此，充分了解正交分析平臺，并及時向這些平臺的團隊提示研究方向，將有助于項目的成功。后續(xù)文章將介紹相關進展，敬請關注。
特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關指南和數(shù)據(jù)的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學術期刊、官方網(wǎng)絡報道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。 參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。
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