上周，“袁來如此”專欄就藥物開發(fā)過程中如何緩解或消除對LBA定量分析方法干擾的策略展開了詳細介紹(袁來如此｜大分子生物分析概論（六）上：LBA定量抗體藥物的背景干擾及其消除)，本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點關注抗體生物藥的定量分析。
“袁來如此”專欄系廣州博濟醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學術專欄，內(nèi)容均為博濟醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。
LBA測試方法常用于定量生物基質(zhì)中抗體藥物的濃度，根據(jù)測試格式的不同，LBA可以測定游離藥物的濃度或藥物總量。游離藥物是指不與靶點結合的治療性抗體。藥物總量則指游離的加上結合了靶標的藥物。由于PK數(shù)據(jù)至關重要，相關監(jiān)管指南和行業(yè)共識都對定量方法的驗證提出了相關建議，包括應對干擾的一些方面。
游離的抗體藥物的測定通常使用抗原或中和性抗獨特型抗體(anti-ID)作為捕獲抗體。檢測抗體可以是中和性anti-ID、非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗體（如抗人IgG2特異性抗體）或抗藥物抗體的框架突變（anti-framework mutations）的抗體。抗體藥物總量可被非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗體或抗藥物抗體的框架突變的抗體捕獲和檢測。但是，很少能得到非中和性anti-IDs，因為在大多數(shù)情況下，生產(chǎn)anti-IDs時會產(chǎn)生很多中和性anti-IDs，但非中和性anti-IDs的產(chǎn)生量卻很少。
游離抗體藥物的定量在技術上是具有挑戰(zhàn)性的，特別是當可溶性靶標在樣本中處于高水平時，許多基質(zhì)成分可以顯著改變可溶性靶標的水平或影響藥物與可溶性靶標的結合，從而引起游離藥物濃度的變化。此外，這些成分也很有可能對之前所討論的可溶性靶標定量起到干擾。
在定量分析抗體-藥物偶聯(lián)物(ADCs)時，樣本的制備具有特殊意義，因為ADCs可以在采集的樣本中或體內(nèi)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，使本已復雜的ADC生物分析更加復雜化。
即使是單克隆抗體的定量也會受到樣本制備方法的影響。例如，使用EDTA作為抗凝劑會螯合陽離子（如Ca2+和Mg2+），從而影響游離抗體藥物濃度的準確測定，如果這些陽離子是藥物與靶標結合所必需的。
在樣本收集和制備過程中，不理想的程序（如上半篇提到的生物標志物部分所討論的）會從細胞中釋放可溶性靶標，導致樣本中靶標的濃度人為地升高，從而低估了游離抗體的濃度。
為了減少這些潛在的干擾，在對每個抗體藥物進行分析時，都應該優(yōu)化樣本采集程序和檢測條件。正如前文所提到的，制備血清的過程可釋放儲存在血小板中的蛋白質(zhì)，而使用血漿則可避免它的釋放。此外，可以實施樣本增穩(wěn)的條件，如低溫，可以減少在樣本收集過程中蛋白質(zhì)從細胞中釋放出來的量。在檢測試劑存在的情況下先進行樣本酸解處理，再進行中和處理，或在檢測過程中保持樣本的弱酸性，該方法已被證明可以有效地減少來自靶標的干擾。
對于游離抗體藥物的分析，應該優(yōu)化檢測條件，如孵育時間、捕獲試劑的濃度和最低稀釋要求，以最大限度地減少藥物從它的靶標解離。這對與其靶標親和力較低、在血液循環(huán)中可溶性靶標濃度較高的抗體藥物，尤為重要。因此，需要在研究人群中評估稀釋線性度和樣本穩(wěn)定性，以將靶標水平的變化對游離藥物定量的準確性這一影響納入考慮。
當使用抗原捕獲待測物時，高濃度的結合蛋白或可溶性受體（soluble receptor）可能會飽和捕獲試劑，致使游離藥物的濃度被低估。使用中和性anti-ID，而不是藥物靶標，作為捕獲試劑，則可以最大限度的減少這個問題。
樣本中的ADA是基質(zhì)干擾的一個來源。ADA與捕獲抗體（或在均相測試方法中的檢測抗體），結合到抗體藥物上，這一競爭會低估抗體藥物的濃度；非競爭性ADA可使抗體藥物分子交聯(lián)形成大體量的復合物，這也會影響藥物濃度測定的準確性。通過對PK、PD和ADA的結果進行比較，可以驗證研究中是否存在這種干擾，從而相應地解釋相關數(shù)據(jù)。
與生物標記物測定相似，基質(zhì)中的heterophilic抗體和人抗動物抗體是免疫測試中的常見干擾來源，可以用前述相同的方法來減輕干擾的影響。如果使用抗人抗體作為捕獲或檢測試劑，人體基質(zhì)中的人體免疫球蛋白可導致顯著的背景信號，可以選擇使用Isotype-specific anti-human antibody替代pan anti-human antibody，以減少干擾。
生物藥和完全的人源抗體藥都有可能產(chǎn)生ADA（也稱為抗藥物抗體），會導致藥物暴露量的損失、藥效損失和嚴重的不良反應。免疫原性評估是臨床研究中安全性評估的重要組成部分，ADA通常采用分級方法進行檢測（篩查）、確認和表征。ADA測定是半定量的，因為這些測試方法缺乏標準曲線。陽性的定義是在測試切點以上的檢測信號，由未接受藥物的陰性樣本的統(tǒng)計分析確定。
針對抗體藥ADA的測定也主要是通過LBA方法進行的。大多數(shù)ADA免疫分析采用橋接測試格式，即ADA橋接（bridge）/交聯(lián)（crosslink）兩個藥物分子結合。對抗體藥中使用較少的另一種方法是直接結合免疫測試（direct binding immunoassays），其中抗體藥是捕獲試劑，檢測試劑則是檢測ADA的Fc部分。
在ADA檢測中最常見的干擾是抗體藥本身，樣本中的藥物與ADA結合，防止ADA與測試試劑形成復合物，在藥物存在的情況下檢測到ADA的能力，稱為藥物耐藥性。
在臨床和非臨床ADA試驗方法驗證過程中，監(jiān)管機構會要求評估和排除這樣的干擾，可以通過在藥物濃度預期較低的時間點（drug wash-out phase）收集樣本進行ADA測試來緩解藥物干擾。在某些情況下，通過酸分離可以提高藥物耐受性。
（1）使用酸解離藥物-ADA復合物；
(2)在檢測試劑的存在的情況下中和樣本；
(3)進行測試
使用高靈敏度的分析方法和稀釋樣本是提高耐藥性的有效方法，用藥物捕獲ADA并通過Fc區(qū)域檢測ADA的直接結合式LBA方法可能較少受到藥物干擾，在這種方法中，只要ADA的一端可與藥物捕獲結合，就能檢測到ADA。
橋接的測試格式則要求ADA的兩端結合到測試試劑，Wu等人描述了一個直接結合式，以檢測藥物特異性的ADAs（IgE等型），并通過萃取抗體量總量，進而檢測copurified 藥物來定量ADA，這樣可以完全消除藥物干擾。Neubert等人通過protein G extraction，然后使用LC-MS檢測copurified藥物，證明了此方法的可行性。表1 列舉了一些用于破壞ADA-藥物復合物，以提高ADA檢測靈敏度的方法（詳見擴展閱讀#2）。限于篇幅，本文不詳細逐一討論，請參閱本文末的參考文獻。
樣本基質(zhì)中的藥物靶標也可能干擾ADA檢測，導致假陽性或陰性結果，橋接捕獲和檢測試劑的multimeric可溶性靶標能夠產(chǎn)生假陽性結果。有報道稱，在ADA測試中，含有CD20的細胞膜片段會對atumumab產(chǎn)生基質(zhì)干擾，陰性結果可能是由于可溶性靶標與捕獲和/或檢測抗體結合，從而阻斷中和性ADA的檢測。下面的樣本預處理，即用阻斷性抗體結合靶標，或用結合蛋白對靶標進行阻斷以及免疫消耗靶標，都可以消除這種干擾。例如，在針對ranibizumab的ADA方法開發(fā)過程中得到了證實。
雖然，大多數(shù)學者認為未使用生物藥的個人不會有ADA，但有時在給藥前就會檢測到先前存在的抗體。值得一提的是，先前存在的抗體并不是干擾，且可能結合到抗體藥物的任何地方。例如，檢測到并確認了對panitumumab的中和性ADA，但報道說這些交叉反應性抗體并未改變藥物PK或其安全性。
盡管如此，先前的ADA總是使得測試和結果解釋變得更復雜。滴度和特異性測試有助于了解先前存在的抗體對給藥后ADA發(fā)生率的貢獻，針對cetuximab的先前存在的抗體有臨床相關性，即先前存在的IgE抗體與嚴重的超敏反應有關。當一個抗體藥物含有某個天然蛋白的免疫原性結構域而且大多數(shù)人以前可能接觸到該結構域時，就很可能會有預先存在的ADAs。在recombinant therapeutic immunotoxins，即anti-CD3-diptheria toxin 和anti-CD22 Pseudomonas exotoxin A的臨床研究中，就觀察到先前存在的ADA。
表1. 用于破壞ADA-藥物復合物，以提高ADA檢測靈敏度的方法
在類風濕關節(jié)炎患者中較為常見的類風濕因子(rheumatoid factor，RF)，它是針對IgG的Fc區(qū)域的抗體，主要為IgM等型抗體。RF的結合親和力低，預期不會在ADA測試中產(chǎn)生陽性信號，然而工程改造過的抗體藥物可能對RF有更高的親和力，從而可能在ADA檢測中產(chǎn)生陽性信號。Araujo等人證明，在給藥前的樣本中，RF產(chǎn)生了陽性信號，而使用抗人IgM抗體的樣本預處理會減少RF的作用。這種方法可能會影響IgM等型的ADA檢測，作者篩查了含有和不含有抗IgM抗體的樣本，并監(jiān)測藥物治療期間滴度的增加。
可溶性蛋白生物標志物、治療性抗體和ADA的生物分析是藥物開發(fā)中不可分割的一部分，每一種分析物都有其自身的挑戰(zhàn)。避免基質(zhì)干擾最有效的方法是對靶標生物學和待測物本身具有扎實的理論基礎，并著重關注測試/分析方法的特異性。
分析技術也可能在防止或減輕測試干擾方面發(fā)揮重要作用。在很多情況下，稀釋是減少干擾的有效工具，而最高的稀釋倍數(shù)受到檢測靈敏度的限制。高靈敏度的分析平臺在高稀釋條件下，可以提供有效的工具，以盡量減少來自基質(zhì)的干擾，分離和純化技術的改進可以有效地將待測物從干擾因子中分離出來。例如，在ADA分析中，有效地從抗體藥物-ADA復合物中定量分離出ADA就能解決其藥物耐受性問題。
MS與LC結合已經(jīng)成為一種強大的定量方法，并且越來越多的應用在蛋白藥物 (尤其是抗體藥物偶聯(lián)物)和生物標志物的生物分析上。與LBA方法相比較，干擾對它的似乎不那么重要，因為MS是特異性很強的分析方法。雖然分析特異性在完全消除干擾方面會非常有幫助，但如果待測物在生物學上是完全等同的（identical），它也可能使生物分析變得極其復雜。
在許多情況下，MS能夠檢測許多不同待測物的混合物，而LBA方法只能檢測一種待測物。因此，LC-MS/MS在生物分析中發(fā)揮越來越重要的作用。本系列后續(xù)文章將介紹大分子生物分析中LC-MS/MS方法。敬請關注。
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1. Schwickart M, et al. Interference in immunoassays to support therapeutic antibody development in preclinical and clinical studies. Bioanalysis (2014) 6(14), 1939–1951
2. DeSilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 2003;20(11):1885–900.
3. Kroll MH, Elin RJ. Interference with clinical laboratory analyses. Clin. Chem. 40(11 Pt 1), 1996–2005 (1994).
4. Tate J, Ward G. Interferences in immunoassay. Clin. Biochem. Rev. 25(2), 105–120 (2004).
5. Weber TH, et al. Endogenous interference in immunoassays in clinical chemistry. A review. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 201, 77–82 (1990).
6. Levinson SS, et al. Towards a better understanding of heterophile (and the like) antibody interference with modern immunoassays. Clin. Chim. Acta 325(1–2), 1–15 (2002).
7. Kricka LJ. Human anti-animal antibody interferences in immunological assays. Clin. Chem. 45(7), 942–956 (1999).
8. Bolstad N, et al. Heterophilic antibody interference in commercial immunoassays; a screening study using paired native and pre-blocked sera. Clin. Chem. Lab.Med. 49(12), 2001–2006 (2011).
9. Stevenson LF, et al. Parallelism: considerations for the development, validation and implementation of PK and biomarker ligand-binding assays. Bioanalysis 6(2),185–198 (2014).
10. Lee JW, et al. Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement. Pharm. Res. 23(2), 312–328 (2006).
11. Emerson JF, et al. Screening for interference in immunoassays. Clin. Chem. 49(7), 1163–1169 (2003).
12. Dimeski G. Interference testing. Clin. Biochem. Rev. 29(Suppl. 1), S43–S48 (2008).
13. Muller W, et al. Interference of IgM rheumatoid factor with nephelometric C-reactive protein determinations. J. Immunol. Methods 80(1), 77–90 (1985).
14. Kelly MM, et al. Increased detection of interleukin-5 in sputum by addition of protease inhibitors. Eur. Respir. J. 18(4), 685–691 (2001).
15. Salimi-Moosavi H, et al. Novel approaches using alkaline or acid/guanidine treatment to eliminate therapeutic antibody interference in the measurement of total target ligand. J. Pharm. Biomed. Anal.51(5), 1128–1133 (2010).
16. DeSilva B, et al. 2012 white paper on recent issues in bioanalysis and alignment of multiple guidelines. Bioanalysis 4(18), 2213–2226 (2012).
17. Partridge MA, et al. Minimizing target interference in PK immunoassays: new approaches for low pH-sample treatment. Bioanalysis 5(15), 1897–1910 (2013).
18. Verch T, et al. Pharmacokinetic immunoassay methods in the presence of soluble target. J. Immunol. Methods 361(1–2), 75–81 (2010).
19. Koren E, et al. Recommendations on risk-based strategies for detection and characterization of antibodies against biotechnology products. J. Immunol. Methods 333(1–2), 1–9 (2008).
20. Stubenrauch K, et al. Generic anti-drug antibody assay with drug tolerance in serum samples from mice exposed to human antibodies. Anal.Biochem. 430(2), 193–199 (2012).
21. Patton A, et al. An acid dissociation bridging ELISA for detection of antibodies directed against therapeutic proteins in the presence of antigen. J. Immunol. Methods 304(1–2), 189–195 (2005).
22. Zhong ZD, et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J. Immunol. Methods 355(1–2), 21–28 (2010).
23. Xue L, Rup B. Evaluation of pre-existing antibody presence as a risk factor for post-treatment anti-drug antibody induction: analysis of human clinical study data for multiple biotherapeutics. AAPS J. 15(3), 893–896 (2013).
24. Chung CH, et al. Cetuximab induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. N. Engl. J. Med. 358(11), 1109–1117 (2008).
25. Kelley, M, et al., Theoretical considerations and practical approaches to address the effect of anti-drug antibody (ADA) on quantification of biotherapeutics in circulation. AAPS J, 2013. 15(3): p. 646-58.
