本期《袁來(lái)如此》為系列文章《大分子生物分析概論》的第十三篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，對(duì)評(píng)估藥物臨床前PK/PD時(shí)，開(kāi)發(fā)和選擇LBA方法的策略作初步介紹。
由于內(nèi)容篇幅較長(zhǎng)，本文將采取上下篇形式進(jìn)行推送，敬請(qǐng)垂注！《袁來(lái)如此》專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號(hào)打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。
1.導(dǎo)論
藥物發(fā)現(xiàn)是一個(gè)快速的transformative的過(guò)程，其包括靶標(biāo)識(shí)別、靶標(biāo)驗(yàn)證、先導(dǎo)藥物的識(shí)別和優(yōu)化。隨著項(xiàng)目推進(jìn)經(jīng)過(guò)這些階段，對(duì)生物分析的需求也在相應(yīng)地改變。開(kāi)發(fā)合適的生物分析方法可以提供藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)（PK/PD）的寶貴數(shù)據(jù)，以支持在新藥研發(fā)項(xiàng)目不同階段中關(guān)鍵的藥效和安全性研究，從而為項(xiàng)目的進(jìn)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在新藥早期的發(fā)現(xiàn)階段，會(huì)同時(shí)考慮不同藥物模式（drug modalities）的多個(gè)分子。一般有多種模式可供選擇，取決于靶標(biāo)及其位置，例如，傳統(tǒng)的小分子、多肽、單克隆抗體、抗體-藥物偶聯(lián)物、納米抗體、融合蛋白藥物、雙特異性生物藥和寡核苷酸。在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，藥物的快速發(fā)現(xiàn)以及快速開(kāi)發(fā)正推動(dòng)著生物分析領(lǐng)域的發(fā)展和演進(jìn)。這種演進(jìn)的主要內(nèi)容是，縮短分析運(yùn)行時(shí)間，實(shí)施multiplex分析，提高靈敏度，降低樣品體積的消耗，實(shí)現(xiàn)分析測(cè)試的自動(dòng)化。
本文關(guān)注的重點(diǎn)是臨床前蛋白藥物生物分析方法的開(kāi)發(fā)策略，即LBA分析平臺(tái)的選擇和方法開(kāi)發(fā)中的關(guān)鍵注意事項(xiàng)。本系列之前的文章，基本是關(guān)注用于臨床樣本分析的LBA方法。為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，在此文中僅評(píng)估用于檢測(cè)蛋白藥物的sandwich format的LBA，而蛋白藥物在大多數(shù)情況下，意味著單克隆抗體。雖然相關(guān)技術(shù)有多方面的進(jìn)步，本文將重點(diǎn)關(guān)注已經(jīng)商業(yè)化和在生物分析行業(yè)十分流行的技術(shù)。文末的參考可以引導(dǎo)讀者非常詳細(xì)地了解相關(guān)內(nèi)容。
目前最流行的3種技術(shù)是ELISA、電化學(xué)發(fā)光（ECL、MSD、NJ、USA）和Gyrolab®（Gyros Protein Technologies、Uppsala、Sweden）。 同時(shí)，本文會(huì)簡(jiǎn)要地涵蓋以下幾項(xiàng)不經(jīng)常使用但具有超高靈敏度的技術(shù)：如基于Single Molecule Array平臺(tái)（單分子陣列，Simoa™），單分子計(jì)數(shù)[SMC™]的Erenna® 平臺(tái)（Singulex Inc、CA、USA），免疫聚合酶鏈反應(yīng)平臺(tái)（immuno-polymerase chain reaction、immuno-PCR、 Imperacer®、Chimera Biotec GmbH、Dortmund、Germany）。另外，還會(huì)簡(jiǎn)要介紹multiplexing的Luminex平臺(tái)（Luminex xMAPR、Luminex Corporation、TX、USA）。在藥物發(fā)現(xiàn)階段，分析方法開(kāi)發(fā)是生物分析的主要內(nèi)容之一，同時(shí)，應(yīng)當(dāng)特別考慮評(píng)估耐受性（tolerance）和分子完整性（molecular integrity）。
2.臨床前LBA方法的關(guān)鍵參數(shù)
用于藥物發(fā)現(xiàn)階段的生物分析方法有5個(gè)重要參數(shù)：樣品體積要求，定量的動(dòng)態(tài)范圍，測(cè)試運(yùn)行時(shí)間，靈敏度和自動(dòng)化程度。本文將簡(jiǎn)要地評(píng)估這些參數(shù)，并介紹這些參數(shù)在選擇檢測(cè)平臺(tái)時(shí)發(fā)揮的重要作用。
1) 樣本體積消耗
從小鼠身上單次采集的血清或血漿樣本的體積約為50ml。隨著在動(dòng)物研究中嘗試實(shí)施3R（替換replacement，減少reduction 和細(xì)化refinement ），生物分析業(yè)界正在探索多種微體積采樣方法，而這將進(jìn)一步大幅度地減少樣本體積。另外，在分析小鼠腦脊液等基質(zhì)的樣本時(shí)，只有2-5ml的體積可用?？紤]到有可能意外損失樣本，故從動(dòng)物獲得的樣本體積應(yīng)足以分析樣本至少兩次。因此，應(yīng)當(dāng)首選能夠使用低樣本體積的分析技術(shù)和平臺(tái)。
2) 定量動(dòng)態(tài)范圍
能夠在寬廣的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，至少包含3-4個(gè)數(shù)量級(jí)，進(jìn)行定量分析是極其有益的。對(duì)于PK分析，這允許較高的最小稀釋要求（minimum required dilution，MRD），以盡量減少樣本基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)為低劑量給藥的樣本提供所需的定量靈敏度。同樣，對(duì)于PD，它允許在更寬廣的范圍內(nèi)測(cè)試平行性（parallelism），從而允許對(duì)含有高濃度生物標(biāo)志物的樣品進(jìn)行大幅度的稀釋。對(duì)于生物標(biāo)志物測(cè)量，稀釋還有助于最大限度地減少樣本和基于緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)曲線（替代基質(zhì)）之間的基質(zhì)差異，從而更精確地生成定量數(shù)據(jù)。
3) 分析運(yùn)行時(shí)間
分析運(yùn)行時(shí)間是實(shí)施PK/PD樣本分析所需時(shí)間，假定使用之前已為該應(yīng)用開(kāi)發(fā)分析方法，這也意味著假定試劑已標(biāo)記，緩沖液已制備，并且相關(guān)儀器也已準(zhǔn)備就緒。在non-GLP臨床前生物分析實(shí)驗(yàn)室中，時(shí)間是至關(guān)重要的；在大多數(shù)情況下，最終目標(biāo)是提供可靠，且可以重現(xiàn)的數(shù)據(jù)，同時(shí)保持較短的分析運(yùn)行時(shí)間。這就提高了實(shí)驗(yàn)室的效率，并允許該部門同時(shí)支持多個(gè)項(xiàng)目。分析96樣本微孔板的運(yùn)行時(shí)間可以在1-5小時(shí)的范圍之間，具體取決于采用的分析技術(shù)（對(duì)于某些分析技術(shù)，有額外的隔夜捕獲步驟overnight capture step）。
4) 靈敏度
大多數(shù)傳統(tǒng)的單克隆抗體的PK定量LLOQ在幾個(gè)ng/ml范圍。一些高效力藥物分子（需要低劑量）和低豐度（或下調(diào)了的）的生物標(biāo)志物可能需要更高的靈敏度。應(yīng)當(dāng)依據(jù)個(gè)案的情況為這些應(yīng)用選擇相應(yīng)的分析平臺(tái)。此外，高靈敏度的分析方法是高度依賴所使用的試劑，因此獲得高特異性和高親和力的試劑可以大大提高定量的靈敏度。提升分析靈敏度也同時(shí)降低了對(duì)樣本體積的要求，見(jiàn)1）。
5) 自動(dòng)化
自動(dòng)化平臺(tái)可縮短分析人員操作的時(shí)間，提高生物分析部門的效率。在臨床前藥物開(kāi)發(fā)的環(huán)境中，分析平臺(tái)的完全自動(dòng)化，在需要開(kāi)發(fā)分析方法且進(jìn)行常規(guī)樣本分析的情況下是非常有益的。同時(shí)，對(duì)于方法開(kāi)發(fā)，優(yōu)化和因基質(zhì)或物種變化而進(jìn)行的方法認(rèn)證，需要能夠修改自動(dòng)化平臺(tái)上的檢測(cè)方法的靈活性。
除了分析測(cè)試自動(dòng)化之外，還可以自動(dòng)化地制備標(biāo)準(zhǔn)品（standards）和質(zhì)量控制樣品（QCs），從而節(jié)省時(shí)間，降低珍貴參照（比）物料（reference material）的使用和成本，并減少手動(dòng)移液產(chǎn)生的誤差。一些分析測(cè)試平臺(tái)，如Gyrolab，允許檢測(cè)的全自動(dòng)化，而Hamilton和HPD300這樣的平臺(tái)，則可以允許自動(dòng)化移液體，或制備標(biāo)準(zhǔn)品和QCs。超高靈敏度的Simoa™平臺(tái)也支持自動(dòng)化地樣本檢測(cè)。
3.臨床前LBA免疫測(cè)試平臺(tái)
目前，有多種LBA測(cè)試平臺(tái)在新藥開(kāi)發(fā)中得到應(yīng)用。表1列出了若干LBA測(cè)試平臺(tái)及其比較。本文將進(jìn)一步介紹其中幾種在生物分析行業(yè)中應(yīng)用比較廣泛的平臺(tái)。由于為臨床前研究開(kāi)發(fā)分析方法所選擇的LBA平臺(tái)，很可能會(huì)繼續(xù)在臨床研究中繼續(xù)使用，因此，選擇合適的測(cè)試平臺(tái)，將會(huì)是影響深遠(yuǎn)的一個(gè)重大決定。
表1. 若干LBA測(cè)試平臺(tái)相關(guān)特征的比較
備注：上表中的方法未全部在文中詳細(xì)介紹。
近年來(lái)，一系列immunoassay的新技術(shù)，特別是基于微（磁）珠（beads，magnetic，etc.）的技術(shù)，從測(cè)試格式的物理學(xué)/物理化學(xué)層次，待測(cè)物的捕獲，檢測(cè)信號(hào)的收集/放大，數(shù)據(jù)處理等方面，實(shí)現(xiàn)了顯著改善，并取得了相當(dāng)?shù)纳虡I(yè)性成功，雖然這些新方法在化學(xué)和生物學(xué)層次，仍然是基于抗體-抗原的結(jié)合作用以及基本的夾心式immunoassay。本文選擇若干得到廣泛商業(yè)應(yīng)用的測(cè)試平臺(tái)，及其在臨床前生物分析方法開(kāi)發(fā)的應(yīng)用作初步介紹，希望起到拋磚引玉的目的，引發(fā)更多關(guān)于新的分析測(cè)試技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的相關(guān)討論、交流和研究。
ELISA平臺(tái)
ELISA是生物制藥行業(yè)內(nèi)外使用最廣泛的配體結(jié)合式（LBA）檢測(cè)平臺(tái)。ELISA的測(cè)試格式包括直接式、間接式和夾心式；ELISA經(jīng)常用作與開(kāi)發(fā)中的新分析平臺(tái)進(jìn)行比較的基礎(chǔ)；在96孔板上，通常對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)孔（duplicate）測(cè)定，手動(dòng)或半自動(dòng)運(yùn)行。通常使用比色法的檢測(cè)試劑，但有時(shí)也使用其他檢測(cè)試劑，如發(fā)光（luminescence）和熒光（fluorescence）。通常，對(duì)ELISA方法，需要監(jiān)測(cè)試劑，如抗體（antibodies）、配體（ligands）、緩沖液（buffers）以及批次的變化。
幾十年來(lái)，傳統(tǒng)的ELISA一直是蛋白質(zhì)定量分析最常用的技術(shù)，因此也是最可靠的技術(shù)之一。即使在今天，大多數(shù)生物標(biāo)志物的商業(yè)檢測(cè)試劑盒都是基于ELISA的。多數(shù)新分析技術(shù)都與作為金標(biāo)準(zhǔn)的ELISA比較。但是，這種分析技術(shù)也有缺點(diǎn)，例如，測(cè)試運(yùn)行時(shí)間約長(zhǎng)為 4-5 小時(shí)，樣品體積消耗大（測(cè)定體積為100 ml），靈敏度低與LLOQ在大多數(shù)情況下接近低-中ng/ml，以及狹窄定量動(dòng)態(tài)范圍（2-3 數(shù)量級(jí)）。這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于某些臨床前生物分析的應(yīng)用仍然很有吸引力，比如血清單克隆抗體的PK。該平臺(tái)還提供了在方法開(kāi)發(fā)早期階段評(píng)估測(cè)試方法不同部分的靈活性。表2列出了不同檢測(cè)平臺(tái)的性能，以一個(gè)mAb藥物為例。
表2. 與ELISA比色法檢測(cè)相比較，一個(gè)mAb在若干檢測(cè)平臺(tái)上LBA方法參數(shù)的比較
備注：上表中的方法未全部在文中詳細(xì)介紹。
電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence，MSD)平臺(tái)
MSD平臺(tái)是一種基于微孔板的測(cè)試格式，它利用電化學(xué)發(fā)光（ECL）信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。在這個(gè)平臺(tái)上，免疫測(cè)試格式類似于用于藥物定量和target sample measurements的典型ELISA格式，但預(yù)計(jì)靈敏度會(huì)因使用化學(xué)發(fā)光而增加。MSD平臺(tái)似乎主要在檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生和收集上，相對(duì)于ELISA有顯著改善：MSD采用SULFO-TAG（三聯(lián)吡啶釕）是一種發(fā)光底物，其分子量約為1000Da（大約是HRP的1/40），因此空間位阻小，易于標(biāo)記抗體，且不易妨礙其與待測(cè)物或其它抗體的結(jié)合。SULFO-TAG在陽(yáng)極表面失去電子，發(fā)生氧化，在三丙胺陽(yáng)離子自由基的催化及三角形脈沖電壓激發(fā)下，可產(chǎn)生高效、穩(wěn)定、連續(xù)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，使得檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)并穩(wěn)定（見(jiàn)圖1）。
圖1. MSD的電化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)
MSD的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)在生物分析行業(yè)廣受歡迎。它保持了ELISA格式的優(yōu)點(diǎn)，如方法開(kāi)發(fā)的靈活性，另外在其它領(lǐng)域也非常出色，如較小的樣品體積要求（測(cè)定體積為25–30 ml），更高的靈敏度（低-中pg/ml）和寬泛的動(dòng)態(tài)范圍（4-5個(gè)數(shù)量級(jí)）。當(dāng)以均相的測(cè)試格式運(yùn)行時(shí)，此平臺(tái)可能受到鉤效應(yīng)（hook effect）的影響。鉤效應(yīng)起源于不合適的抗體-抗原濃度比例，但是可以減輕甚至消除的。此外，試劑和微孔板容易有批次間的變化，因此，強(qiáng)烈建議在批次之間進(jìn)行交叉比較。
MSD微孔板的孔底為石墨底，捕獲抗體包被載量可提升10-50倍，檢測(cè)范圍比ELISA擴(kuò)展了10-100倍，定量動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)5-6個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度可提升10-1000倍（fg/ml-pg/ml級(jí)別）。根據(jù)對(duì)血清免疫學(xué)中的“帶現(xiàn)象”的理解，可推測(cè)：包被抗體載量可以根據(jù)檢測(cè)靈敏度的需要進(jìn)行調(diào)整，以避免鉤效應(yīng)（hook effect）。分析運(yùn)行時(shí)間接近約3-4小時(shí)，但考慮到該平臺(tái)提供的其它優(yōu)勢(shì)，測(cè)試時(shí)間可被視為一個(gè)合理的折中。該平臺(tái)允許同時(shí)運(yùn)行多個(gè)96孔板，因此在分析數(shù)百個(gè)樣品時(shí)，測(cè)試一個(gè)或多個(gè)96孔板也只需要基本相同的時(shí)間，這一點(diǎn)可能非常有利。此平臺(tái)不是自動(dòng)化的，因?yàn)樗枰治鋈藛T參與每個(gè)步驟。此外，該平臺(tái)還提供與實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS）的集成和US FDA 21 CFR part 11的合規(guī)性，允許分析方法結(jié)果容易地轉(zhuǎn)移到GLP的環(huán)境中。
Gyrolab平臺(tái)
Gyrolab是一個(gè)非96微孔板的免疫測(cè)試平臺(tái)，具有液體處理功能（liquid handling capability），使用小體積的樣本和試劑在光盤（CD）上實(shí)施免疫測(cè)定。該測(cè)試格式使用biotinylated捕獲試劑和標(biāo)記有fluorophore的檢測(cè)試劑，在納升體積的使用親和力微珠填料的捕獲柱（nanoliter volume affinity capture column）上進(jìn)行測(cè)試。利用CD的微觀結(jié)構(gòu)確定樣品和試劑的體積，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)CD將樣本加到捕獲柱上。在每個(gè)CD上，有96（在1000nlCD上）-112（在20或200nl CD上）個(gè)微觀結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生96-112個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（1小時(shí)/CD運(yùn)行時(shí)間）。在Gyrolab工作站上，樣品處理完全自動(dòng)化，液體處理臂將樣品和試劑從微孔板轉(zhuǎn)移到CD，并通過(guò)激光/檢測(cè)器測(cè)定每個(gè)捕獲柱的熒光信號(hào)。基礎(chǔ)的Gyrolab xPlore™ 允許無(wú)人值守地一次分析1張CD，而Gyrolab xPand™允許分析多達(dá)5張CD（即480-560個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)）。在大多數(shù)情況下，動(dòng)態(tài)范圍為3-4個(gè)數(shù)量級(jí)。該平臺(tái)的靈敏度可與MSD的ECL平臺(tái)（低-中pg/ml）相媲美。
Gyrolab是一個(gè)自動(dòng)化的微流體系統(tǒng)（microfluidic system），且其離心操作能夠高效地處理微量體積，因此大多數(shù)重復(fù)(duplicate）分析只需要小于5ml的樣本體積，就可以從同一微孔板重新分析未使用的樣品。該平臺(tái)使用包被了捕獲抗體的微珠來(lái)捕獲待測(cè)物，與下面討論的Luminex和Simoa平臺(tái)在捕獲待測(cè)物的原理上，即在更大的固相表面積上有更多的捕獲抗體（與ELISA相比），似乎有異曲同工之妙，總體效果是提升了捕獲待測(cè)物的效率，提升了靈敏度。Gyrolab的一個(gè)出色特點(diǎn)是，可以選擇不同的CD來(lái)調(diào)整定量的動(dòng)態(tài)范圍，以滿足對(duì)低或高濃度樣本的分析。該分析技術(shù)平臺(tái)對(duì)于大分子的常規(guī)臨床前PK/PD分析無(wú)疑是非常有效的。此平臺(tái)在縮短檢測(cè)時(shí)間方面非常有效，無(wú)需人工移液和參與分析的每一步驟。這使得該平臺(tái)對(duì)開(kāi)發(fā)方法和分析樣本都極具吸引力。此外，該平臺(tái)還提供實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)集成和FDA 21 CFR part 11合規(guī)性，能夠?qū)⒎治龇椒ㄝp松地轉(zhuǎn)移到GLP環(huán)境中去。
Gyros的一個(gè)可能缺點(diǎn)是，如果以基于微孔板格式開(kāi)發(fā)了分析方法檢測(cè)，則相同的試劑在轉(zhuǎn)移到Gyros時(shí)可能會(huì)性能欠佳，并且可能需要顯著地優(yōu)化才能獲得最佳性能。這是因?yàn)镚yros的孵育時(shí)間極短，需要高結(jié)合效率的捕獲試劑，而基于微孔板的檢測(cè)則不需要這種試劑，因?yàn)檩^長(zhǎng)的孵育時(shí)間抵消了該需求。因此，如果使用Gyros，則需要在同一平臺(tái)對(duì)試劑進(jìn)行篩選，然后測(cè)試其分析性能，并開(kāi)發(fā)完整的分析方法。
BIAcore平臺(tái)
基于BIAcore平臺(tái)的藥物分析，依賴于待測(cè)物與固定在傳感器芯片（sensor chip surface）表面的待測(cè)物特異的試劑的相互作用。BIAcore實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)該結(jié)合相互作用，并讀出以相對(duì)響應(yīng)單元（relative response units，RU）為單位的響應(yīng)，該響應(yīng)與Surface Plasmon Resonance（SPR）角度的變化相關(guān)，并且由傳感器芯片表面的液體薄膜的折射率變化所決定。折射率的變化與芯片表面結(jié)合的質(zhì)量成正比。這種實(shí)時(shí)的無(wú)標(biāo)記技術(shù)與典型的免疫測(cè)定法有很大的不同，免疫測(cè)定法需要多個(gè)孵育和洗滌步驟，以及用于信號(hào)讀出的標(biāo)記檢測(cè)抗體（labeled detection antibody）。對(duì)于臨床前藥物分析，可以將抗藥物特異性抗體固定在芯片表面實(shí)施通用化檢測(cè)，當(dāng)樣本流經(jīng)分析隔室（cell）時(shí)，該抗體將結(jié)合樣本中所含有的mAb藥物。其它方式，如在芯片上固定待測(cè)物，也可用于特定的定量分析。對(duì)于此平臺(tái)，在驗(yàn)證期間必須經(jīng)過(guò)10個(gè)周期的殘留（carry-over）測(cè)試，并且還應(yīng)確定最大信號(hào)值（相對(duì)于背景值）的信號(hào)噪聲比（signal-to-noise ratio），以評(píng)估樣本分析期間的方法運(yùn)行性能。此外，還必須評(píng)估在執(zhí)行大批量樣本分析的較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的芯片穩(wěn)定性（分析方法是特定于所使用的芯片類型）。由于該平臺(tái)通常運(yùn)行一夜或更長(zhǎng)時(shí)間，故樣本和試劑的穩(wěn)定性必須比典型的免疫測(cè)試方法具有更長(zhǎng)的短期穩(wěn)定性（超過(guò)24小時(shí)），而且在Biacore T200上，樣本的總通量（overall sample throughput）較低。此外，單個(gè)分析運(yùn)行需要包含校準(zhǔn)曲線后和運(yùn)行序列中間隔的QC樣本。通常，這對(duì)應(yīng)于一個(gè)微孔板的校準(zhǔn)品（calibration standards，Cs）和樣本。
可以對(duì)BIAcore實(shí)施IQ/OQ/PQ驗(yàn)證，以滿足符合21 CFR Part 11的要求。使BIAcore儀器達(dá)到GLP合規(guī)的狀態(tài)不是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程，需要投入大量時(shí)間來(lái)處理數(shù)據(jù)傳輸（data transfer）和合適的校準(zhǔn)（隨時(shí)間推移的）等問(wèn)題。
該測(cè)試平臺(tái)更多地用于LBA關(guān)鍵試劑的篩選和表征。LBA關(guān)鍵試劑一般定義為：對(duì)待測(cè)物（analyte）特異性的LBA分析試劑，如抗體、多肽、蛋白質(zhì)、耦合物（標(biāo)記），作為試劑的藥物和ADA試劑（陽(yáng)性和陰性對(duì)照品）。
多通道（multiplexing）分析技術(shù)
Multiplexing測(cè)試方法可以節(jié)省時(shí)間和寶貴的樣品。但是，存在一個(gè)局限：即它們經(jīng)過(guò)嚴(yán)格優(yōu)化，只能在指定范圍和基質(zhì)中使用。不同的待測(cè)物對(duì)不同的基質(zhì)和稀釋的反應(yīng)不同，因此，對(duì)于某個(gè)待測(cè)物，優(yōu)化參數(shù)的偏差可能需要重新優(yōu)化整個(gè)multiplexing檢測(cè)方法。在臨床前生物分析中，需要探索了解多種藥物、多個(gè)藥物變異體、多種藥物的組合和多種生物標(biāo)志物。因此，檢測(cè)的靈活性是非常關(guān)鍵的，對(duì)此multiplexing可能幫助意義不是很大。
在樣本體積十分有限的特殊情況下，可以探索multiplexing。允許自主開(kāi)發(fā)multiplexing方法的平臺(tái)包括：Luminex的xMAP技術(shù)，使用獨(dú)特的dyed beads，并取決于所使用的儀器（MAGPIX、LUMINEX 200或FLEXMAP 3D），可以分析50-500待測(cè)物；Quanterix SR-X，使用6個(gè)獨(dú)特的磁珠，可以multiplexing多達(dá)6個(gè)待測(cè)物；Quanterix SP-X可以multiplexing到10個(gè)待測(cè)物，使用其基于平面陣列的空間分離的化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)。其中，MSD允許從黃金標(biāo)準(zhǔn)的singleplex平臺(tái)直接轉(zhuǎn)換到U-PLEX平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)；Quanterix的SR-X和SP-X平臺(tái)在multiplexing時(shí)能夠提供超高靈敏度。
Luminex平臺(tái)
常用的Luminex®100/200™系統(tǒng)是基于流式細(xì)胞學(xué)（flow cytometry）原理的靈活程度很高的分析儀。該系統(tǒng)使用很小的樣本體積，在單個(gè)微孔板的孔/井中multiplex（同時(shí)測(cè)定）多達(dá)100個(gè)待測(cè)物。該平臺(tái)可以操作許多檢測(cè)格式，包括核酸測(cè)試方法（nucleic acid assays）、受體-配體測(cè)試方法（receptor-ligand assays）、免疫測(cè)試方法（immunoassays）和酶測(cè)試方法（enzymatic assays），并提供快速且經(jīng)濟(jì)高效的生物測(cè)試結(jié)果。
該系統(tǒng)是xMAP® 3個(gè)核心檢測(cè)技術(shù)的組合。第1個(gè)是xMAP微球，這是一個(gè)熒光染色，微米大小的聚苯乙烯微球系列，既作為標(biāo)識(shí)符，又充當(dāng)建立測(cè)試方法的固體表面。第2個(gè)是基于流式細(xì)胞學(xué)的儀器（flow cytometry-based instrument），Luminex 100/200分析儀集成了關(guān)鍵的xMAP檢測(cè)組件，如激光、光學(xué)器件、流體技術(shù)和高速數(shù)字信號(hào)處理器。第3個(gè)組件是xPONENT®軟件，它專門設(shè)計(jì)為基于方案（protocol-based）的數(shù)據(jù)采集方式，具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)回歸分析的能力。
Luminex利用特定染料的珠子（beads），該珠子包被有特定的抗待測(cè)物抗體。添加待測(cè)物孵育后，再添加熒光標(biāo)記的抗體，以檢測(cè)和定量待測(cè)物。此項(xiàng)技術(shù)使用供應(yīng)商預(yù)先生產(chǎn)的試劑盒，主要用于PD檢測(cè)，即生物標(biāo)志物的定量分析，并且采用多通路檢測(cè)（multiplexing）的方式。商業(yè)化的試劑盒數(shù)量巨大，據(jù)稱達(dá)1,300余種。一個(gè)樣本可以用于測(cè)定多個(gè)待測(cè)物，據(jù)稱最多可達(dá)500個(gè)，并且可以對(duì)每種待測(cè)物設(shè)置接受標(biāo)準(zhǔn)。不足之處是：不同待測(cè)物珠子（analyte beads）有交互干擾（cross-talk）的傾向，而且測(cè)試方法對(duì)光敏感，因此必須采取特殊的預(yù)防措施。
超高靈敏的定量分析技術(shù)
對(duì)于某些藥物和樣本基質(zhì)，可能需要具有fg/ml-低pg/ml的超高靈敏度的定量分析方法。相關(guān)狀況包括定量低豐度的生物標(biāo)志物，對(duì)強(qiáng)效藥物分子的PK分析和定量極易受到基質(zhì)效應(yīng)影響的待測(cè)物，顯然，大幅度稀釋樣本會(huì)提升對(duì)測(cè)定平臺(tái)靈敏度和定量動(dòng)態(tài)范圍的要求。
目前，允許自主開(kāi)發(fā)方法的超高靈敏度的定量分析平臺(tái)包括來(lái)自Quanterix，基于Simoa™的數(shù)字化ELISA，來(lái)自Singulex的使用單分子計(jì)數(shù)（single molecule counting）的Erenna™，以及來(lái)自Chimera Biotec GmbH的基于免疫PCR（immuno-PCR）的Imperacer。
之前已經(jīng)發(fā)表的文章詳細(xì)評(píng)估了這3種超高靈敏度的分析技術(shù)，以及其它不太流行的分析技術(shù)。這3種技術(shù)都是需要供應(yīng)商提供檢測(cè)方法的分析儀器，但都允許用戶自主開(kāi)發(fā)檢測(cè)方法。當(dāng)擁有實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）儀器（thermal cycler fitted with a fluorimeter）時(shí)，還可以獨(dú)立于供應(yīng)商提供的試劑或儀器開(kāi)發(fā)Immuno-PCR方法。在使用這些技術(shù)時(shí)，需要特別注意一些非常規(guī)情況，包括Simoa™ 的磁珠偶合，DNA與檢測(cè)試劑的偶合，以及無(wú)污染地操作immuno-PCR。
基于單分子陣列（Simoa™）的數(shù)字化ELISA
來(lái)自Quanterix公司的Simoa™數(shù)字化ELISA是一個(gè)很有前途的平臺(tái)，它可以使蛋白質(zhì)定量達(dá)到fg/ml。該技術(shù)采用基于微觀順磁珠（microscopic paramagnetic bead）的免疫測(cè)試方法，并結(jié)合獨(dú)特的信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。數(shù)字化ELISA分2個(gè)階段實(shí)施。在捕獲抗原的第1階段，涂有捕獲試劑的微觀磁珠與樣品混合，然后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體（biotinlabeled detection antibody）和鏈球菌素-β-半乳糖酶（streptavidin–b-galactosidase）。然后，這些珠子被加載到光盤上，光盤上裝有一系列體積為飛升（femtoliter）大小的微井陣列。每個(gè)微井的直徑為4.5mm，能夠容納直徑為2.7mm的珠子數(shù)目只能為1或者為0。被硅膠墊片密封的微井含有熒光底物，其用于信號(hào)生成和放大（圖2）。Simoa™ 技術(shù)在定量分析的第二階段采用了獨(dú)特的信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)。微井（50飛升）中濃度相對(duì)較高的發(fā)出熒光的產(chǎn)物（陽(yáng)性事件）和白光散射（white light scattering）測(cè)定的總珠子負(fù)載可以由標(biāo)準(zhǔn)的CCD攝像機(jī)輕松地檢測(cè)到和記錄。通過(guò)改進(jìn)幾個(gè)檢測(cè)步驟，Simoa™ 實(shí)現(xiàn)了超高靈敏度。
圖2. 在飛升體積（femtoliter）的井陣列中裝載，密封和成像單個(gè)順磁珠
因?yàn)樵?00mL的反應(yīng)體積中有約200,000個(gè)磁珠，而每個(gè)磁珠捕獲約80,000個(gè)抗體分子，抗體-待測(cè)蛋白的比值和平衡允許高效地在給定的示例中，>70%捕獲待測(cè)物。由于溶液中有這么多的磁珠，而且可以在溶液中運(yùn)動(dòng)，所以捕獲效率進(jìn)一步提高，因?yàn)槊總€(gè)目標(biāo)蛋白在不到1分鐘時(shí)間內(nèi)就會(huì)遇到磁珠。這與傳統(tǒng)的LBA方法中，固定在一個(gè)表面的捕獲抗體與待測(cè)物的緩慢結(jié)合完全相反。另外，優(yōu)化了的biotin-labeled detection antibody與streptavidin–b-galactosidase之間的比值，可減少檢測(cè)背景并最大化特定信號(hào)的采集。與Simoa™檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，相關(guān)熒光信號(hào)可以通過(guò)熒光底物（fluorogenic substrate）的酶消化（enzymatic digestion），而進(jìn)一步放大。
Simoa™ 檢測(cè)系統(tǒng)能夠檢測(cè)到單個(gè)結(jié)合事件（a single binding event），該事件可以在低濃度下以數(shù)字方式獲得（靈敏度增高，數(shù)字化ELISA），或在高濃度模式下以模擬的方式獲得（擴(kuò)展了的定量動(dòng)態(tài)范圍）。熒光用于檢測(cè)酶活性，并能夠測(cè)定每個(gè)磁珠上酶的平均值。與下面描述的Erenna®平臺(tái)一樣，結(jié)合數(shù)字式和模擬式的讀數(shù)功能，可以實(shí)現(xiàn)非常寬廣的定量動(dòng)態(tài)范圍。由于最終信號(hào)采集是在平面陣列上完成標(biāo)準(zhǔn)成像，因此與使用 Erenna®等流體系統(tǒng)的數(shù)值讀出相比，數(shù)據(jù)采集更快。
盡管Erenna® 和Simoa™ 平臺(tái)具有數(shù)字讀出和寬廣的定量動(dòng)態(tài)范圍等共同點(diǎn)，但Simoa™ 平臺(tái)是一個(gè)完全自動(dòng)化的系統(tǒng)，該儀器可以實(shí)施樣品稀釋（高達(dá)1:10稀釋），混合，洗滌，孵化和數(shù)據(jù)采集步驟。Simoa™ 能夠同時(shí)測(cè)定多達(dá)10種不同的待測(cè)物（multiplexing）。這是通過(guò)對(duì)單個(gè)捕獲抗體使用不同的dye linkers來(lái)實(shí)現(xiàn)的。之后，對(duì)陣列進(jìn)行多個(gè)波長(zhǎng)的熒光成像，以識(shí)別擁有不同dye linkers的亞組，并確定是否存在enzyme reporter標(biāo)記。與Singulex和Quanterix一樣，有許多試劑盒可供選擇。也可以“定制”開(kāi)發(fā)，或“自主開(kāi)發(fā)”分析方法。
憑借較高的靈敏度、multiplexing和自動(dòng)化功能，該平臺(tái)看起來(lái)非常理想。Simoa™平臺(tái)與LIMS系統(tǒng)兼容，其軟件滿足監(jiān)管級(jí)別的生物分析據(jù)FDA 21 CFR part 11的合規(guī)性要求。筆者認(rèn)為該平臺(tái)因其超高靈敏度（可以使用微量樣本體積）和自動(dòng)化操作，在相當(dāng)?shù)某潭壬峡梢蕴娲鶪yrolab平臺(tái)，用于臨床前PK樣本分析。
Singulex Erenna®平臺(tái)
Erenna®免疫測(cè)試系統(tǒng)利用兩步的過(guò)程實(shí)現(xiàn)超高靈敏度定量分析（ultrasensitive assays）。最初，使用biotinylated capture試劑和熒光標(biāo)記檢測(cè)試劑，在96孔板中實(shí)施基于珠子（beads）的夾心式測(cè)試格式。從珠子上洗脫的被捕獲待測(cè)物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)384孔的讀取板（reading plate），然后將該讀取板放置到檢測(cè)儀器上。然后樣本一個(gè)接一個(gè)地通過(guò)毛細(xì)管進(jìn)入flow cell，并在其中實(shí)施激光誘導(dǎo)的單分子檢測(cè)分析。該平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)是寬廣的定量動(dòng)態(tài)范圍，其通過(guò)獨(dú)特的軟件曲線擬合算法實(shí)現(xiàn)。該算法利用了多次讀數(shù)，提升了靈敏度。
與其它測(cè)試平臺(tái)相比，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，但一些線下的自動(dòng)化設(shè)備可用于洗滌和轉(zhuǎn)移步驟。該平臺(tái)通常用于PD檢測(cè)，但也可用于PK定量分析。對(duì)供應(yīng)商生產(chǎn)和供應(yīng)的試劑盒，其穩(wěn)定性必須由最終用戶評(píng)估，因?yàn)樵噭┑姆€(wěn)定性通常是未知的。此外，可以購(gòu)買通用試劑，以開(kāi)發(fā)內(nèi)部的檢測(cè)試劑，而且，基于微孔板的格式也能兼容使用96或384孔板的平臺(tái)。供應(yīng)商建議對(duì)校準(zhǔn)品（Cs）進(jìn)行3次復(fù)測(cè)（triplicate），以便在低濃度下進(jìn)行精確分析?？梢酝ㄟ^(guò)IQ/OQ程序，與內(nèi)部PQ相結(jié)合，驗(yàn)證Erenna®平臺(tái)。如果將Erenna®與LIMS結(jié)合，以實(shí)施監(jiān)管級(jí)生物分析，則一個(gè)選擇是使用讀出的三個(gè)信號(hào)之一進(jìn)行濃度分析。但是，動(dòng)態(tài)范圍和靈敏度可能會(huì)受到影響，具體取決于選擇哪個(gè)讀出的信號(hào)。
Immuno-PCR (Polymerase Chain Reaction)
Immuno-PCR（Chimera）是一種擴(kuò)增免疫測(cè)試技術(shù)（signal amplification immunoassay）。它涉及DNA標(biāo)記的檢測(cè)抗體的擴(kuò)增，從而提高靈敏度。與ELISA中使用的抗體-酶偶合物（antibody–enzyme conjugates）不同，IPCR中的關(guān)鍵試劑是抗體-DNA偶合物（antibody–DNA conjugates），其中一個(gè)DNA標(biāo)記（marker）與檢測(cè)抗體相偶合。然后，將DNA polymerase加入到反應(yīng)主混合物之中，就可以放大檢測(cè)信號(hào)，并通過(guò)定量PCR（qPCR）而定量測(cè)定DNA-marker的濃度，從而定量分析analyte–antibody immunocomplex。因此，該技術(shù)主要改進(jìn)了檢測(cè)信號(hào)的放大方法。但是，如果檢測(cè)抗體與血清或血漿中的成分發(fā)生交叉反應(yīng)，該平臺(tái)可能容易受到強(qiáng)大基質(zhì)效應(yīng)的影響。因此，在方法驗(yàn)證期間必須評(píng)估信噪比，并用于確定樣本分析期間方法的性能。
該平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)包括寬廣的定量動(dòng)態(tài)范圍和提升了的靈敏度，這對(duì)PD分析是很有益的。與 Erenna®平臺(tái)一樣，檢測(cè)試劑高度依賴于供應(yīng)商，對(duì)于大批量樣本分析來(lái)說(shuō)，成本可能很高。如同MSD、Erenna®和其它基于珠子的平臺(tái)一樣，應(yīng)特別注意標(biāo)記試劑和微孔板批次的變化。由于該平臺(tái)依賴于PCR技術(shù)，因此在處理樣本、試劑和移液器槍頭時(shí)必須小心謹(jǐn)慎，以避免污染。此外，數(shù)據(jù)分析可能也會(huì)較為麻煩（cumbersome）。
7. 特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來(lái)自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊, 官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開(kāi)渠道, 不涉及任何保密信息。 參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
參 考 文 獻(xiàn)
1. Eangoor, P. (2020). "A guided approach to preclinical bioanalysis of proteins using immunoassays for pharmacokinetic and pharmacodynamic assessments." Bioanalysis 12(16): 1105-1110.
2. Fischer SK, et al. Emerging technologies to increase ligand binding assay sensitivity. AAPS J. 17(1), 93–101 (2015).
3. Dudal S, et al. Assay formats: recommendation for best practices and harmonization from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16, 194–205 (2014).
4. Patel SR, et al. Microsampling for quantitative bioanalysis, an industry update: output from an AAPS/EBF survey. Bioanalysis 11(7), 619–628 (2019).
5. Roman J, et al. Application of miniaturized immunoassays to discovery pharmacokinetic bioanalysis. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 63(3), 227–235 (2011).
6. Leary BA, et al. Bioanalytical platform comparison using a generic human IgG PK assay format. J. Immunol. Methods 397(1–2), 28–36 (2013).
7. Duo J, et al. Surface plasmon resonance as a tool for ligand-binding assay reagent characterization in bioanalysis of biotherapeutics. Bioanalysis 10(8), 559–576 (2018).
8. Spengler M, et al. Highly sensitive ligand-binding assays in pre-clinical and clinical applications: immuno-PCR and other emerging techniques. Analyst 140(18), 6175–6194 (2015).
9. Lind K, Kubista M. Development and evaluation of three real-time immuno-PCR assemblages for quantification of PSA. J. Immunol. Methods 304(1–2), 107–116 (2005).
10. Attallah C, et al. Design and validation of an immuno-PCR assay for IFN-α2b quantification in human plasma. Bioanalysis 11(23), 2175–2188 (2019).
11. Woodbury N, et al. Application of multiplexed pharmacokinetic immunoassay to quantify in vivo drug forms and coadministered biologics. Bioanalysis 11(24), 2251–2268 (2019).
12. Stevenson LF, Purushothama S. Parallelism: considerations for the development, validation and implementation of PK and biomarker ligand-binding assays. Bioanalysis 6(2), 185–198 (2014).
13. Lee JW, et al. Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement. Pharm. Res. 23(2), 312–328 (2006).
14. Stevenson L, et al. Large molecule specific assay operation: recommendation for best practices and harmonization from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16(1), 83–88 (2014).
15. Desilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm. Res. 20(11), 1885–1900 (2003).
16. Lee JW, et al. Bioanalytical approaches to quantify ‘total’ and ‘free’ therapeutic antibodies and their targets: technical challenges and PK/PD applications over the course of drug development. AAPS J. 13(1), 99–110 (2011).
17. Pearson JT, Rock DA. Bioanalytical approaches to assess the proteolytic stability of therapeutic fusion proteins. Bioanalysis 7(23), 3035–3051 (2015).
18. Vasicek LA, et al. Direct quantitation of therapeutic antibodies for pharmacokinetic studies using immuno-purification and intact mass analysis. Bioanalysis 11(3), 203–213 (2019).
關(guān)于博濟(jì)醫(yī)藥 臨床研究服務(wù)：
博濟(jì)醫(yī)藥擁有一支規(guī)模龐大、專業(yè)成熟的臨床研究隊(duì)伍，可提供包括醫(yī)學(xué)、項(xiàng)目管理、監(jiān)查、稽查、數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析、生物樣本檢測(cè)在內(nèi)的臨床試驗(yàn)全流程解決方案。截至2020年，博濟(jì)醫(yī)藥服務(wù)的客戶超1000家，完成800多項(xiàng)臨床試驗(yàn)項(xiàng)目，助力客戶獲得新藥證書60多項(xiàng)、生產(chǎn)批件超過(guò)80項(xiàng)。擁有豐富的臨床試驗(yàn)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，服務(wù)項(xiàng)目涵蓋臨床研究各個(gè)領(lǐng)域，在腫瘤、肝病、消化等創(chuàng)新藥領(lǐng)域擁有獨(dú)特的臨床服務(wù)體系。
博濟(jì)醫(yī)藥在全國(guó)設(shè)有40多個(gè)臨床監(jiān)查網(wǎng)點(diǎn)，與全國(guó)近600個(gè)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)展開(kāi)合作，并運(yùn)用ORACLE OC/RDC及CTMS系統(tǒng)，控制臨床數(shù)據(jù)采集的及時(shí)性、管理臨床試驗(yàn)過(guò)程的規(guī)范性。
